Введение. Фосфор является одним из наиболее значимых макроэлементов, необходимых для обеспечения нормального роста и развития растений. Он играет ключевую роль в энергетическом обмене, фотосинтезе, синтезе нуклеиновых кислот и других жизненно важных процессах [1, 2]. Однако подавляющее большинство соединений фосфора в почве (около 90 %) находится в неусвояемых или трудноусвояемых для растений формах, что затрудняет получение высоких урожаев без внесения фосфорных удобрений [3]. Несмотря на масштабное применение, их эффективность остается достаточно низкой и часто не превышает даже 30 %, что приводит к значительным финансовым затратам и негативным экологическим последствиям [4]. Так, миграция соединений фосфора с сельскохозяйственных полей в составе поверхностного и подземного стока приводит к эвтрофикации водных объектов, что резко снижает качество и количество источников водопользования [5, 6]. Кроме того, нерастворимые соединения фосфора в почве негативно влияют на рекультивацию посттехногенных ландшафтов, пос­кольку его недоступность для поглощения растениями замедляет восстановление почвенно-растительного покрова [7].Перечисленные проблемы, особенно в условиях усиления техногенного пресса, быстрого роста численности населения и, соответственно, продовольственных нужд [8], подталкивают исследователей к поиску экологически безопасных и экономически выгодных способов трансформации нерастворимых соединений почвенного фосфора в растворимые формы. Большим потенциалом в данном вопросе обладают фосфатмобилизирующие микроорганизмы (PSM), в т. ч. бактерии, обитающие в почве, и биопрепараты на их основе. Причем приоритет отдается микроорганизмам, извлеченным из природных источников региона предполагаемого применения, так как они адаптированы к местным почвенным условиям, температуре и другим факторам, что облегчает их использование и повышает эффективность [9]. Ввиду чего, несмотря на общие закономерности функционирования фосфатмобилизирующих микроорганизмов, наиболее эффективным решением остается применение биопрепаратов на основе их аборигенных штаммов. Именно такие бактерии максимально адаптированы к специфическим климатическим условиям, в то время как интродуцированные штаммы могут не выжить или проявлять низкую активность в непривычной для них среде, а также вызвать риск нарушения баланса естественного биоценоза почвы [10].Цель исследования – оценить фосфатмобилизирующую активность микрофлоры основных зональных типов почв Рязанской области.Объекты и методы. С целью оценки численности и состава микробных сообществ методом «конверта» отбирались усредненные пробы основных зональных типов почв Рязанской области: дерново-подзолистой (Касимовский район), серой лесной (Рязанский район) и чернозема выщелоченного (Александро-Невс­кий район).Выделение фосфатсолюбилизирующих штам­мов бактерий проводилось с помощью различных питательных сред: выполнялся посев как на селективную питательную среду (жидкую и твердую), так и на среду общего назначения с последующим пересевом на селективную. Первоначально образцы почвенной суспензии были добавлены в жидкую питательную среду общего назначения, это позволяет мик­роорганизмам размножиться и увеличить свою популяцию, что повышает вероятность выявления целевых видов на селективных средах. Для этих целей был использован БТН-бульон – жидкая среда, служащая основой для культивирования и поддержания роста широкого спектра микроорганизмов. В ее составе содержится белковый ферментативный гидролизат, ферментативный пептон, экстракт автолизированных дрожжей, натрия хлорид и натрия карбонат. Процесс размножения микроорганизмов определялся визуально, по помутнению бульона.После помутнения бульона из питательной среды общего назначения был выполнен пересев на селективную среду (NBRIP-агар) для PSB, содержащую нерастворимый ортофосфат кальция в виде мелкодисперсной взвеси, придающей среде мутность. Фосфатмобилизирующие бактерии используют его в качестве источника питания, что приводит к прояснению среды вокруг растущих колоний. Образование таких зон гало является общепринятым критерием для быстрого отбора фосфатмобилизующих микроорганизмов и проведения предварительной оценки их активности [11]. На основании этого признака из каждой почвенной пробы были отобраны изолированные колонии на NBRIP-агаре, а для дальнейших исследований было выбрано по одному штамму из каждого типа почвы, показавшему максимальный диаметр зоны гало в ходе первичного скрининга.Для визуализации деятельности фосфатмобилизующих микроорганизмов в питательную среду добавлялись индикаторы, а именно бромтимоловый синий и метиленовый красный. Исходный цвет данных сред – синий и желтыйсоответственно. При изменении реакции среды в кислую сторону (в результате выделения органических кислот микроорганизмами) происходит изменение цвета индикаторов: бромтимоловый синий становится желтым, а метиленовый красный – красным.Помимо твердой среды использовалась и жидкая, состав которой был аналогичен по содержанию солей, но не содержал агар и pH-индикаторы.Для посева на жидкую среду (БТН-бульон) в каждую колбу вливали по 0,1 мл почвенной суспензии. Посев на твердую среду NBRIP из жидкого бульона проводили методом Дригальского: 0,1 мл суспензии вносили в первую чашку Петри и равномерно распределяли по поверхности агара стерильным шпателем, затем тем же шпателем без стерилизации осуществляли посев во вторую, третью и четвертую чашки. Таким образом, получали нулевое, первое, второе и третье разведения. По завершении инкубации в термостате в течение 1–7 сут на чашке Петри с третьим разведением каждая отдельная бактериальная клетка формировала изолированную колонию. После чего осуществлялся перенос отдельной, хорошо изолированной колонии на новую чашку Петри с использованием техники «истощающего штриха».В качестве положительного контроля на агаризованную среду NBRIP был осуществлен посев колоний штамма Enterobacter ludwigii, известного фосфатмобилизатора, применяемого в сельскохозяйственной практике.Ключевым критерием оценки активности выделенных микроорганизмов являлась концентрация мобилизуемого ими фосфора, количественное определение которого осуществлялось спектрофотометрическим методом. Для чего исследовалось по 1 мл жидкой питательной среды, соответствующей каждому из трех типов почв. Во все колбы со средой добавляли фотометрические реагенты и доводили объем растворов до 50 мл дистиллированной водой (рис. 1).Пробы инкубировались в течение 40 мин. В результате химической реакции происходило формирование окрашенного соединения, интенсивность которого, проявляющаяся в насыщенном синем цвете, была пропорциональна концентрации фосфора в исследуемых пробах. Контролем являлись пробы среды с колониями штамма Enterobacter ludwigii.   Рис. 1. Появление синей окраски соединений в результате реакции фосфорас фотометрическими реагентами в исследуемых образцах жидкой питательной средыThe appearance of a blue color of compounds as a result of the reaction of phosphoruswith photometric reagents in the studied samples of liquid nutrient medium  Результаты и их обсуждение. Было установлено, что образцы всех исследуемых почв содержат бактерии, обладающие фосфатмобилизующей активностью и образующие зоны гало вокруг колоний, а также приводящие к изменению цвета индикатора в составе питательной среды за счет выделения кислот, что лежит в основе превращения нерастворимых соединений фосфора в растворимые. Изменение цвета бромтимолового синего на желтый четко визуализировалось по краям зон гало на чашках Петри, соответствующих разным почвенным образцам (рис. 2).    Рис. 2. Выделение чистых культур PSB на NBRIP-агаре методом ДригальскогоIsolation of pure cultures of PSB on NBRIP agar using the Drygalski method  Вокруг колоний, выделенных из чернозема выщелоченного, формировались зоны гало диаметром 16 мм, а из серой лесной почвы – 15 мм. В случае с дерново-подзолистой почвой диаметр зон гало составил только 8 мм. Полученные результаты свидетельствуют о более низкой способности бактерий дерново-подзолистой почвы растворять соединения фосфора. Это может быть связано с составом микробного сообщества в данной почве, менее эффективно выделяющего фосфатазы или органические кислоты в процессе жизнедеятельности, о чем свидетельст­вует меньший диаметр зоны изменения цвета – индикатора вокруг колоний данных бактерий (рис. 3).   Рис. 3. Зоны гало вокруг колоний фосфатмобилизующих бактерий, выделенных из почвенных образцов: (1 – чернозем выщелоченный; 2 – серая лесная почва; 3 – дерново-подзолистая почва;4 – контроль (среда без микроорганизмов)Halo zones around colonies of phosphate-mobilizing bacteria isolated from soilsamples: (1 – leached chernozem; 2 – gray forest soil; 3 – sod-podzolic soil;4 – control (environment without microorganisms)  Диаметр зон гало, сформированных вокруг колоний контрольного штамма Enterobacter lud­wigii, составил 20 мм, что свидетельствует о более высокой фосфатсолюбилизирующей способности по сравнению с аборигенными мик­роорганизмами, выделенными из образцов почв Рязанской области (рис. 4).    Рис. 4. Зоны гало вокруг колоний фосфатмобилизирующих бактерий Enterobacter ludwigiiHalo zones around colonies of phosphate-mobilizing bacteria Enterobacter ludwigii  Несмотря на то, что в ходе проведенного исследования штаммы, выделенные из почв Рязанской области, показали меньшую фосфатмобилизующую активность in vitro по сравнению с контрольным штаммом Enterobacter ludwigii, использование аборигенных штаммов для произ­водства биопрепаратов представляется более перспективным в условиях местного применения. Это обусловлено высокой адаптацией аборигенных штаммов к почвенно-климатическим условиям, ввиду чего они более эффективно колонизируют ризосферу и, как следствие, лучше мобилизуют фосфор in situ. Аборигенные штаммы обладают конкурентными преимуществами в борьбе за ресурсы с местной микробиотой и лучше выживают в условиях, характерных для региона [12–14]. Таким образом, полученные в ходе исследования результаты открывают перспективы для дальнейших исследований по отбору и применению эффективных аборигенных фосфатмобилизаторов с целью их использования при разработке биопрепаратов для сельского хозяйства Рязанской области и других регионов с теми же зональными типами почв.С целью изучения динамики фосфат-раство­ряющей активности бактерий проводилось количественное измерение концентрации свободного фосфора в питательной среде. Измерения проводились на 1-е, 6-е и 20-е сут инкубации.Согласно полученным данным (табл. 1), на1-е сут инкубации в питательной среде концентрация свободного фосфора в контрольной пробе (без добавления микроорганизмов) составила 16 мг/л. В пробе с Enterobacter ludwigii концентрация достигла 58 мг/л. Концентрация фосфора в пробах со штаммом, выделенным из черноземной почвы, составила 64 мг/л, из серой лесной – 29, а из дерново-подзолистой – 17 мг/л.  Таблица 1Оптическая плотность и концентрация фосфора в жидкой питательной среде с бактериями из основных зональных типов почв Рязанской области и в контрольных средахна 1-е сутки инкубацииOptical density and phosphorus concentration in liquid nutrient medium with bacteriafrom the main zonal soil types of the Ryazan region and in control media on day 1 of incubation ОбразецОптическая плотность раствора (А)Концентрация P, мг/лСреда с Enterobacter ludwigii0,27658Чернозем выщелоченный0,30364Серая лесная почва0,13929Дерново-подзолистая почва0,08417Контроль (среда без микроорганизмов)0,07916  Полученные данные свидетельствуют о выраженной фосфатмобилизирующей активности штамма, выделенного из чернозема выщелоченного, уже на ранних этапах исследования. Их способность к мобилизации фосфатов (64 мг/л) превосходит даже показатели контрольного штамма Enterobacter ludwigii (58 мг/л), признанного эффективным фосфатмобилизатором.В то же время бактерии из дерново-подзолистой почвы продемонстрировали значительно более низкую активность (17 мг/л), сопоставимую с контрольным образцом без инокуляции (16 мг/л).Данные результаты указывают на различную скорость активации фосфатмобилизирующих процессов в исследуемых почвах. В частности бактериальное сообщество чернозема выщелоченного обладает значительным потенциалом для быстрого улучшения фосфорного питания растений, в отличие от микроорганизмов дерново-подзолистой почвы, требующих, вероятно, более длительного периода адаптации или стимуляции для проявления подобной активности.На 6-е сут инкубации наблюдалась значительная динамика в мобилизации фосфора в питательной среде (табл. 2).  Таблица 2Оптическая плотность и концентрация фосфора в жидкой питательной среде с бактериями из основных зональных типов почв Рязанской области и в контрольных средахна 6-е сутки инкубацииOptical density and phosphorus concentration in liquid nutrient medium with bacteria from the main zonal soil types of the Ryazan region and in control media on the 6th day of incubation ОбразецОптическая плотностьраствора (А)Концентрация P, мг/лСреда с Enterobacter ludwigii0,813194Чернозем выщелоченный0,979236Серая лесная почва0,580136Дерново-подзолистая почва0,975235Контроль (среда без м/о)0,09514  Важно отметить, что штамм, выделенный из черноземной почвы, продемонстрировали вы­сокую фосфатмобилизирующую активность (236 мг/л). Однако наиболее примечательным является то, что на 6-е сут инкубации бактерии, изолированные из дерново-подзолистой почвы, также достигли близких значений (235 мг/л), показав существенный рост активности по сравнению с первыми этапами исследования. Штамм из серой лесной почвы показал промежуточные результаты (136 мг/л).К 20-м сут инкубации (табл. 3) штамм, выделенный из дерново-подзолистой почвы, продемонстрировал наивысшую активность, достигнув концентрации растворимого фосфора 361 мг/л. Данный результат значительно превосходил показатели бактерий из серой лесной почвы (148 мг/л), чернозема выщелоченного (307 мг/л) и даже эталонного штамма Enterobacter ludwigii (287 мг/л).  Таблица 3Оптическая плотность и концентрация фосфора в жидкой питательной среде с бактериями из основных зональных типов почв Рязанской области и в контрольных средахна 20-е сутки инкубацииOptical density and phosphorus concentration in liquid nutrient medium with bacteria from the main zonal soil types of the Ryazan region and in control media on the 20th day of incubation ОбразецОптическая плотность раствора (А)Концентрация P, мг/лСреда с Enterobacter ludwigii1,020287Чернозем выщелоченный1,086307Серая лесная почва0,577148Дерново-подзолистая почва1,257361Контроль (среда без микроорганизмов)0,12515  Полученные данные указывают на то, что хотя штамм из чернозема выщелоченного изначально, в 1-е сут инкубации, проявляют более высокую скорость мобилизации фосфатов, бактериальное сообщество дерново-подзолистой почвы обладает большим потенциалом для достижения сопоставимого уровня активности при увеличении продолжительности инкубации.При анализе динамики отдельных штаммов микроорганизмов каждой из исследуемых типов почв Рязанской области установлено, что на всех четырех вариантах, включая среду с эталонным штаммом, наблюдается увеличение концентрации растворимого фосфора с тече­нием времени инкубации (рис. 5). Это свидетельствует о нарастании активной работы PSB во времени.   Рис. 5. Динамика изменения концентрации растворимого фосфора в жидкой питательной среде при инкубации (1-е, 6-е и 20-е сут) для эталонного штамма Enterobacter ludwigii и штаммов,выделенных из трех типов почвDynamics of changes in the concentration of soluble phosphorus in liquid nutrient medium duringincubation (1, 6 and 20 days) for the reference strain Enterobacter ludwigii and strains isolatedfrom three types of soils Штамм бактерий из чернозема выщелоченного показал стабильную фосфатмобилизующую активность на протяжении всего эксперимента. Здесь концентрация фосфора увеличивалась постепенно, достигнув 307 мг/л к 20-м сут инкубации, что является вторым по величине результатом после дерново-подзолистой почвы.Штамм, выделенный из серой лесной почвы, проявил наименьшую фосфатмобилизующую активность по сравнению с другими исследованными образцами.Контрольный штамм Enterobacter ludwigii продемонстрировал ожидаемую активность, подтверждая валидность экспериментальной системы. Однако стоит отметить, что бактерии из чернозема выщелоченного и дерново-подзолистой почвы показали сопоставимые, а под конец эксперимента даже более высокие результаты.Данный факт свидетельствует, что, несмотря на меньший диаметр зон гало, наблюдаемый на твердой среде, исследуемые аборигенные микроорганизмы, особенно штаммы из черноземной и дерново-подзолистой почв, обладают значительным потенциалом для мобилизации фосфора в жидкой питательной среде. Это подчеркивает их перспективность в созданиибиоудобрений и обосновывает целесообразность дальнейших исследований, направленных на их идентификацию, изучение свойств и механизмов действия.Заключение. Таким образом, среди выделенных из основных зональных типов почв Рязанской области штаммов максимальную фосфатмобилизующую активность показали микроорганизмы, полученные из чернозема выщелоченного и дерново-подзолистой почвы. Так, концентрации фос­фора высвобожденного бактериями чернозема выщелоченного превысили таковые у эталонного фосфатмобилизатора Enterobacter ludwigii на 7 % за 20 сут экспозиции, а в случае со штаммами дерново-подзолистой почвы указанная разница составляла уже более 25 %.На основании полученных данных можно утверждать о перспективности использования аборигенных микроорганизмов, адаптированных к местным почвенным условиям, для разработки биопрепаратов, направленных на повышение доступности фосфора для растений.