Введение. В практике воспроизводства крупного рогатого скота важным моментом является период хранения спермы, поскольку этого требуют различные технологические операции. Известным способом хранения спермы является ее криоконсервация [1].Криоконсервация спермы имеет большое значение для животноводства, поскольку она ускоряет распространение генетического разнооб­разия. При низких температурах сперматозоиды имеют низкий метаболизм и могут сохраняться продолжительное время в соответствующих разбавителях спермы [2, 3].Однако криоконсервация значительно снижает качество сперматозоидов. Основные структурные повреждения сперматозоидов связаны с процедурой замораживания и последующего оттаивания, спровоцированы фазовым переходом воды в лед и обратно [4–6]. В процессе криоконсервации меняются структура, функции мембраны. Деструктивные изменения в мембранах в свою очередь приводят к нарушению внутриклеточной компартментации веществ [7].Используемые к настоящему времени в скотоводстве основные показатели биологической полноценности сперматозоидов (концентрация, подвижность, микробиологический анализ) косвенно оценивают их фертильность. Более подробное представление о морфологическом и генетическом потенциале сперматозоидов можно получить благодаря применению современных методов молекулярной и клеточной биологии.Цель исследования – анализ влияния цикла замораживания и оттаивания на морфофункциональные параметры сперматозоидов быков.Задачи: оценить влияние криоконсервации на морфологию и функции сперматозоидов; современными методами микроскопии (электронной и лазерной интерференционной) определить качественные показатели нативных и оттаянных сперматозоидов.Объекты и методы. Исследования проводили in vitro на базе лаборатории в ООО «Нижегородское» по племенной работе (Кстовский муниципальный район Нижегородской области), на базе кафедры физиологии, биохимии и акушерства Нижегородского ГАТУ и кафедры физиологии и анатомии ННГУ им. Н.И. Лобачевского.Объектом исследования служила спермопродукция черно-пестрых быков. Сбор спермы проводили в соответствии с Национальной технологией замораживания и использования спермы племенных быков-производителей. Были использованы эякуляты быков в возрасте 3 лет. Использовали свежеполученное семя с подвижностью сперматозоидов более 7 баллов, минимальным количеством аномальных клеток [8].Сперму разбавляли стерильной средой BioXcell (Франция). Исследовали нативную разбавленную разбавителем BioXcell сперму (группа I), сперму после глубокой заморозки (группа II). Заморозку проводили в открытых гранулах. Сперматозоиды замораживали в течение 7,5 мин до температуры –145 °С, затем контейнер с образцами помещали в жидкий азот (–196 °С).Подвижность, среднюю скорость движения сперматозоидов оценивали на спермоанализаторе SA-500 фирмы «Биола» (Россия).Для оценки ультраструктуры сперматозоидов было проведено электронно-микроскопическое исследование. Эякулят фиксировали 2,5 % раствором глутарового альдегида и 1 % осмиевой кислотой и заливали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе Hitachi SU8220 (Япония). При электронно-микроскопическом исследовании сперматозоидов проводили анализ формы ядра, состояния хроматина, положения и формы акросомы.Методом лазеpной интеpфеpенционной микpоcкопии исследовали морфологию сперматозоидов. Доcтоинcтвом метода являетcя отcут­cтвие фикcации, окpашивания, обpаботки кон­тpаcтиpующими вещеcтвами, котоpые могут приводить к изменениям объекта исследования [9]. Лазерную интерференционную микроскопию сперматозоидов проводили на лазерном интерференционном микроскопе МИМ-340 (Россия, Екатеринбург), используя лазер с длиной волны 650 нм и объектив с увеличением 30×. Для зах­вата изображений применяли видеокамеру VS-415U (НПК Videoscan, Россия) с разрешением 782×582 пикселей. Реконструкцию фазового изображения из интерферограмм осуществляли методом фазовых шагов в программе WinPhast, для последующей работы с изображениями использовали программу FIJI (США) и Microcal Origin (Microcal Inc., США). Полученные данные обрабатывали с помощью программы MS Excel. Обработка результатов проводилась по параметрическому t-крите­рию Стьюдента.Результаты и их обсуждение. Анализ подвижности сперматозоидов в свежеполученном и замороженном семени быков выявил значительные различия по этому показателю (табл. 1). После криоконсервации подвижность спер­матозоидов уменьшилась на 13,77 % (р ≤ 0,05).В процессе замораживания-оттаивания на 12,95 % снизилась средняя скорость движения сперматозоидов с 85,62 ±3,54 до 74,53 ± 2,48 % (р ≤ 0,05).Подвижность, средняя скорость движения сперматозоидов не всегда являются показателем фертильности, целостности ДНК. Разработка и применение новых методов оценки качества и жизнеспособности сперматозоидов позволит провести оценку морфологических нарушений спермиев, определить их причины и повысить показатели оплодотворяющей способности [10, 11]. Таблица 1Фертильные показатели сперматозоидов быков и их ультраструктура Показатель, %Нативные сперматозоидыОттаянные сперматозоидыПодвижность82,51±5,9571,15±4,34*Средняя скорость движения85,62±3,5474,53±2,48*Форма ядра – нормальная95,57±2,2994,85±2,67Хроматин конденсированный94,74±4,0685,21±4,39*Положение акросомы – нормальное97,32±3,4191,24±2,39*Форма акросомы – нормальная90,24±2,2481,36±2,19*Здесь и далее: среднее ± SEM, «*» – статистически значимые различия по отношению к нативным сперматозоидам, р ≤ 0,05.  Провести оценку состояния клеточных органелл сперматозоида позволяет количественное электронно-микроскопическое исследование. Изучение сперматозоидов электронно-микроскопи­ческим методом показало, что хроматин нативных сперматозоидов зрелый. После криоконсервации хроматин был недостаточно конденсированный, содержащий фибриллы [11]. В процессе замораживания-оттаивания во всех группах отмечалось снижение доли сперматозоидов с интактными акросомами. Известно, что акросома насыщена водой, что является причиной ее высокой чувствительности к замораживанию. Целостность акросомы, показатель интактности, имеет большое значение для оплодотворения и последующего проникновения сперматозоидов в прозрачную зону. У 6,23 % оттаянных сперматозоидов было измененное положение акросомы, у 18,64 % сперматозоидов была изменена форма акросомы. Нарушение положения и формы акросомы ассоциированы с нарушением подвижности [12].Электронно-микроскопическое исследование ядра показало, что воздействие криоконсервации на ядро сперматозоидов было минимальным.Так как окрашивание сперматозоидов при использовании стандартных методов микроскопии может повлиять на их жизнеспособность, следующим этапом исследования было установление размеров сперматозоидов методом лазерной интерференционной микроскопии. Метод основан на анализе изменения показателя преломления клеточных структур. Главным преимуществом метода является возможность исследования интактных, нативных клеток без применения красителей, использование которых может привести к дополнительному нежелательному воздействию на исследуемые биологические объекты.Размеры сперматозоидов влияют не только на скорость движения спермиев, но и на оплодотворяющую способность. Установили, что длина головки нативных спермиев составляла 9,53 ± 0,62 мкм; шейки – 1,42 ± 0,21; тела – 12,57 ± 1,91, хвоста – 46,82 ± 5,25 мкм (табл. 2). Таблица 2Размеры сперматозоидов быков, мкм ПоказательНативные сперматозоидыОттаянные сперматозоидыДлина головки спермия9,53±0,628,32±0,55*Ширина головки спермия4,82±0,214,71±0,32Длина шейки спермия1,42±0,211,38±0,36Длина тела спермия12,57±1,9110,32±2,13*Длина хвоста спермия46,82±5,2542,36±4,35*  После криоконсервации у 7,01 % спермиев показано уменьшение длины головки, у 17,90 % – уменьшение длины тела, у 9,53 % – уменьшение длины хвоста (р ≤ 0,05). Изменение размеров сперматозоидов, вероятно, обусловлено осмотическим, тепловым шоком, потерей клеткой жидкости, окислительным стрессом, которые изменяют конфигурацию липидов и белков мембраны и снижают жизнеспособность клеток. У оттаянных сперматозоидов отмечен свернутый хвост, что подтверждает низкую подвижность сперматозоидов, и повышено содержание спермиев с аномальной акросомой, которая играет решающую роль в процессе проникновения сперматозоидов в яйцеклетку.Заключение. Таким образом, проведенное исследование показало, что процесс замораживания и оттаивания семени быков вызывает морфологические и функциональные повреждения сперматозоидов, приводящие к снижению качества спермы. Показатели, получаемые стандартными методами определения морфофункциональных параметров сперматозоидов, не всегда соответствуют высокой оплодотворяющей способности спермы. Поэтому важно использовать методы оценки спермы, которые гарантированно позволят отобрать функционально активные сперматозоиды.Применение методов оптической микроскопии, обладающих сверхразрешением, позволило получить новые данные о молекулярной активности сперматозоидов после размораживания. Полученные с помощью лазерной интерференционной микроскопии данные позволили определить влияние криоконсервации на сперматозоиды в режиме реального времени без фиксации и окрашивания клеток. Исследование сперматозоидов методом электронной сканирующей микроскопии с высокой точностью дало возможность определить основные морфологические параметры клеток.Внедрение в практику животноводства современных методов оценки качества сперматозоидов имеет большое значение для понимания процессов, происходящих при криоконсервации семени, улучшения криовыживаемости сперматозоидов, а также разработки тестов, определяющих оплодотворяющую способность сперматозоидов.