Введение. Фузариоидные грибы (род Fusarium sensu stricto и близкородственные рода) являются значимыми фитопатогенами зерновых культур и встречаются во всех зерносеющих регионах. Они вызывают заболевания различных органов у широкого круга растений-хозяев, накапливаются в сельскохозяйственной продукции и контаминируют ее микотоксинами. Заболевания могут протекать бессимптомно (при заражении растения видами F. poae, F. Sporotrichioides и F. tricinctum) либо с видимыми проявлениями в виде окрашенного спороношения (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum). Патологическое действие фузариоидных грибов на растение определяется наличием и степенью проявления факторов фитопатогенности, которые существенно варьируют у различных видов и популяций. Внутривидовой полиморфизм фитопатогенных грибов и влияние почвенно-климатических условий способствуют отбору экологически пластичных и патогенных популяций, которые доминируют в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды с невысокой встречаемостью [1–5].Цель исследования – изучение внутривидовой гетерогенности по фитопатогенным свойствам у сибирских штаммов фузариоидных грибов.Задачи: определить фитотоксические свойства метаболитов грибов на семенах и проростках лиственницы и пшеницы; исследовать динамику фитотоксической активности на проростках кукурузы у наиболее активных штаммов; оценить гетерогенность по фитопатогенным свойствам у доминирующего в регионе вида.Объекты и методы. Объектами исследования служили 52 изолята фузариоидных грибов (Fusarium, Neocosmospora) из коллекции лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН. Грибы изолировали в чистую культуру из образцов Triticum aestivum L. и Hordeum vulgare L. с признаками заболевания (колос, зерновки, стебель, корни). Первичную идентификацию осуществляли на основании культурально-морфологических признаков [6–10], с обязательной молекулярно-генетической верификацией – секвенирование ДНК гена фактора элонгации трансляции (TEF-1α) и второй по величине субъединицы РНК-полимеразы (RPB2) [10]. На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей 31 изолята F. sporotrichioides, включая 1 новый сибирский штамм [11], секвенированных по одному локусу. Последовательности выровнены по таксону Atractium stilbaster [10].Фитопатогенные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки на проростках пшеницы сорта Красноярская-12. Исследуемые штаммы высевали на картофельно-сахарозный агар (КСА) в чашки Петри и культивировали их в течение пяти суток при 24 °С в темноте. Семена поверхностно стерилизовали 70 % этанолом в течение 3 мин и замачивали в стерильной воде на 24 ч при 24 °С для набухания. На мицелий гриба раскладывали набухшие семена в количестве 10 штук в трехкратной повторности, контролем служили семена, разложенные на поверхности стерильного КСА. Чашки в течение 7 сут выдерживали в темноте при 24 °С, после чего измеряли длину появившихся ростков (мм) и регистрировали степень их поражения по четырехбалльной шкале: 0 баллов – здоровый росток; 1 балл – точечный некроз ткани; 2 балла – некроз около 50 % площади ткани; 3 балла – гибель.Биотестирование метаболитов проводили на семенах пшеницы сорта Тулунская-12, Larix sibirica Ledeb. и проростках Zea mays L. сорта Лакомка [6]. Иммуноферментный анализ Т2 фузариотоксина проводили стандартным методом (ГОСТ Р 52471-2005) на базе Краевой ветеринарной лаборатории. Культуры грибов выращивали на стерильном рисе в течение 10 сут при 25 °С.    Рис. 1. Филогенетическое дерево на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма F30 и последовательностей Fusarium sporotrichioides из NCBI GenBank с использованием праймеров TEF-1α. Бутстреп-значения более 50 % указаны рядом с кластерами. В качестве внешней группы использовали Atractium stilbaster (Link)  Результаты и их обсуждение. На первом этапе провели оценку влияния метаболитов фузариоидных грибов на токсигенной среде. Установлено, что уровень фитотоксичности варьирует в пределах вида и между отдельными видами по показателям лабораторной всхожести семян пшеницы и лиственницы (табл. 1). В группу высокотоксичных отнесены виды Fusarium sporotrichioides Sherb. и Fusarium oxysporum Schltdl. – средний показатель всхожести семян в пределах каждого вида был ниже контрольного значения на 50 % и более. Группу умеренно токсичных образуют виды Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Neocosmospora solani (Mart.) L. Lombard & Crous и неидентифицированные изоляты из комплекса F. fujikuroi: пределы варьирования лабораторной всхожести составили 27,1–64,1 %. Семена пшеницы оказались более чувствительными к метаболитам Fusarium poae (Peck) Wollenw., Fusarium acuminatum Ellis & Everh. и Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) по сравнению с лиственницей сибирской.  Таблица 1Лабораторная всхожесть семян злаковых и хвойных растений под действием метаболитов сибирских штаммов рода Fusarium Комплекс видов / видКоличество штаммовЛабораторная всхожесть семян, % от контроля*Triticum L.Larix sibiricaFusarium sambucinum species complexF. sambucinum 464,5–103,7**61,3–101,2 F. sporotrichioides1214,2–51,417,9–54,1F. poae447,9–74,169,1–92,3F. culmorum529,5–64,149,8–78,1Fusarium tricinctum species complex F. acuminatum643,1–75,4 57,7–82,3F. avenaceum 827,3–58,430,9–63,3Fusarium oxysporum species complexF. oxysporum 519,4–54,216,9–57,3Fusarium fujikuroi species complexFusarium sp.429,3–61,325,5–64,2NeocosmosporaN. solani427,1–63,524,2–68,1*Всхожесть семян в контроле в расчетах принята за 100 %; 0–30 % – высокая степень фитотоксичности; 30–70 % – средняя; более 70 % – слабая.**Минимальное и максимальное значения в пределах выборки.  Пролонгированный фитотоксический эффект проявился в ингибировании развития стебля и корня (рис. 2). На семисуточных проростках пшеницы ингибирование роста стебля варьировало от 3 до 46 %, главного корня – от 2 до 73 % относительно контроля. Максимальная фитотоксичность характерна для изолятов F. sporotrichioides. Штаммы F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC угнетали развитие в равной степени стебля и корня; N. solani и F. oxysporum сильнее ингибировали корневую систему. На 14-суточных проростках L. sibirica ингибирование роста стебля составило от 8 до 63 %, корневой системы – от 14 до 75 %. Максимальной токсигенностью обладали метаболиты F.oxysporum, F. avenaceum, N. solani, F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC. Динамику фитотоксической активности исследовали на двухсуточных проростках Z. mays, используя фильтраты фитотоксичных культур, полученные на токсигенной среде в течение 49 сут (рис. 3).Для всех исследуемых штаммов характерна высокая фитотоксичность – средние показатели ингибирования роста корней варьировали от 52 до 89 %. Выявлены внутривидовые различия по степени фитотоксической активности и динамике накопления метаболитов. Например, штаммы F. sporotrichioides были разделены на три группы. Штаммы первой группы (50 % исследованных культур) оказывали сильное фитотоксическое действие (более 50 % ингибирования роста) в течение всего периода с постепенным увеличением фитотоксичности до 79–98 %. Штаммы из второй группы (30 %) проявили сначала умеренное фитотоксическое действие (10–25 %), а затем выраженное (39–81 %). Третья группа (20 %) представлена штаммами, которые в начальный период стимулировали развитие корней, но затем отмечено существенное ингибирование (58–87 %). Внутривидовая гетерогенность по фитотоксичности также выявлена у F. avenaceum (ингибирование роста корней 38–74 %), F. Oxysporum (47–98 %), N. solani (58–83 %) и F. fujikuroi SC (44–98 %).   Рис. 2. Морфометрические показатели проростков Triticum aestivum под влиянием метаболитов сибирских штаммов фузариоидных грибов   Рис. 3. Динамика фитотоксической активности сибирских штаммов фузариоидных грибов в отношении корней Zea mays   Для изолятов вида F. sporotrichioides, как наиболее распространенного на исследуемой территории [11], был проведен иммуноферментный анализ на наличие Т2-фузариотоксина. Токсин выявлен во всех исследуемых культурах, однако его концентрация варьировала между отдельными штаммами в пределах вида и среди моноспоровых культур одного штамма (табл. 2).Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина отмечена для штамма Fs11, выделенного из зерновок ячменя. Содержание микотоксина у его моноспоровых культур соответствовало уровню родительского штамма (5,3–5,4 мг/кг) либо было существенно ниже (0,94–2,74 мг/кг). Уровень синтеза токсинов у штаммов, выделенных из зерновок пшеницы, был меньше и находился в пределах 0,05–0,84 мг/кг. Таблица 2 Содержание Т-2 фузариотоксина в культурах Fusarium sporotrichioides,выращенных на рисовом зерне ШтаммИсточник выделенияКонцентрация токсина (мг/кг),Х ср. ± mFs11Зерновки ячменя сорта Ача 5,50±0,89Fs11-3Моноспоровые культуры штамма Fs115,40±0,87Fs11-95,30±0,86Fs11-102,74±0,44Fs11-40,94±0,15Z11-1Зерновки пшеницы, сорт Тулунская-120,84±0,14Z31-5Зерновки пшеницы, сорт Красноярская-120,81±0,13Z37-1Зерновки пшеницы, селекционная линия «К64-2» 0,14±0,02Z12Зерновки пшеницы, сорт Мана-2 0,05±0,014  На следующем этапе оценивали фитопатогенные свойства живых культур F. Sporotrichioides. Исследование проводили на проростках пшеницы сорта Красноярская-12, оценивая длину проростка (патогенность) и наличие некроза корней (агрессивность) по сравнению с контролем. Все исследуемые штаммы достоверно ингибировали развитие проростков по сравнению с контролем: 70 % штаммов снижали длину на 50–79 % (средний показатель группы 67 %); 30 % штаммов – в диапазоне 36–49 % (средний показатель 43 %) (рис. 4). Отмечено наличие некроза в тканях с максимумом до 1,6 балла (по трехбалльной шкале); при этом более чем у 50 % культур степень некроза составила 0,9–1,6 балла.Для токсигенного штамма Fs11 F. Sporotrichioides получены 16 моноконидиальных культур, фитопатогенность которых исследовали аналогичными методами. Установлено, что у 81 % клонов показатели фитопатогенности выше, чем у родительского штамма, длина проростков уменьшилась на 84–95 % по сравнению с контролем. Более 50 % клонов вызывали некрозы корней от 1,8 до 2,6 балла, что превышает исходный показатель в среднем в 1,6 раза. У 19 % моноспоровых культур показатели патогенности достоверно не отличаются от родительского штамма.    Рис. 4. Фитопатогенность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides на проростках Triticum aestivum  Заключение. Сибирские штаммы фузариоидных грибов в различной степени ингибируют лабораторную всхожесть семян и замедляют ростовые процессы злаковых и хвойных растений. Максимальная фитотоксичность отмечена для видов F. sporotrichioides и F. oxysporum, в меньшей степени фитотоксичны F.avenaceum, N. solani и неидентифицированные изоляты F. fujikuroi SC. Выявлены внутривидовые различия по динамике накопления метаболитов и фитотоксичности в отношении проростков Z. mays для видов F.sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N.solani и F. fujikuroi SC, при этом для всех штаммов фитотоксический эффект возрастал (до 98 %) при увеличении времени культивирования.Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина (до 5,5 мг/кг) отмечена у штамма F. sporotrichioides, выделенного из ячменя, и его моноспоровых культур, при этом содержание токсина у клонов существенно варьировало (0,94–5,4 мг/кг). Уровень синтеза токсина у остальных штаммов был ниже и составил 0,05–0,84 мг/кг.Выявлена внутривидовая гетерогенность F. sporotrichioides по фитопатогенности: при моноконидиальном рассеве выщепляются линии, отличные от природного штамма, преимущественно в сторону увеличения патогенности, что указывает на микроклональную структуру популяции по токсикогенным свойствам и свидетельствует о вероятности появления более агрессивных клонов.