сотрудник с 01.01.2015 по 01.01.2025
сотрудник с 01.01.2025 по 01.01.2025
Баранул, Алтайский край, Россия
сотрудник с 01.01.2022 по 01.01.2025
сотрудник с 01.01.2023 по 01.01.2025
сотрудник с 01.01.2021 по 01.01.2025
ВАК 4.1.1 Общее земледелие и растениеводство
ВАК 4.1.3 Агрохимия, агропочвоведение
ВАК 4.1.4 Садоводство, овощеводство, виноградарство и лекарственные культуры
ВАК 4.1.5 Мелиорация, водное хозяйство и агрофизика
ВАК 4.2.1 Патология животных, морфология, физиология, фармакология и токсикология
ВАК 4.2.2 Санитария, гигиена, экология, ветеринарно-санитарная экспертиза и биобезопасность
ВАК 4.2.3 Инфекционные болезни и иммунология животных
ВАК 4.2.4 Частная зоотехния, кормление, технологии приготовления кормов и производства продукции животноводства
ВАК 4.2.5 Разведение, селекция, генетика и биотехнология животных
ВАК 4.3.3 Пищевые системы
ВАК 4.3.5 Биотехнология продуктов питания и биологически активных веществ
УДК 57.084.1 в искусственно контролируемых условиях, например, в лаборатории
Цель исследования – разработка эффективных биотехнологических приемов среднесрочного сохранения коллекционных образцов хмеля в условиях in vitro путем использования питательных сред, позволяющих увеличить продолжительность межпассажных периодов при сохранении жизнеспособности культур. Исследования осуществлялись на базе Алтайского центра прикладной биотехнологии (АлтГУ, Барнаул) в 2025 г. Изучено влияние глюкозы, маннита, нитрата кальция (Ca(NO3)2), хлорхолинхлорида (ССС), салициловой кислоты, абсцизовой кислоты (АБК), канамицина, цефотаксима и состава макро- и микроэлементов питательной среды MS на среднесрочное сохранение хмеля пяти сортов в культуре in vitro. Перспективность питательных сред зависит от генотипов сохраняемых образцов хмеля. Среды, дополненные 3,5 мг/л Ca(NO3)2, поддерживали жизнеспособность регенерантов сортов Фаворит и Брянский на уровне 95 % в течение 12 мес. На данной среде максимальной жизнеспособностью (30 %) характеризовался сорт Таурус. Содержание 1 мг/л АБК в среде обеспечивало 90–100 % сохранность культур в течение 6–7 месяцев, тогда как у сортов Цивильский и Брянский после 1-го года культивирования жизнеспособность составляла 40 %. Применение маннита и ССС показало ограниченную эффективность, сильно зависящую от концентрации и сортовых особенностей. Антибиотик цефотаксим подтвердил свою перспективность, сохраняя до 80 % жизнеспособных эксплантов, тогда как канамицин оказался фитотоксичным и приводил к гибели регенерантов хмеля. Разработанные протоколы позволяют сохранять перспективные генотипы хмеля до 12 мес. в беспересадочной культуре, что имеет большое значение для создания биотехнологических коллекций, снижения трудозатрат и коммерческого применения технологии клонального микроразмножения.
Humulus lupulus L., беспересадочное культивирование, биотехнологические коллекции, генетическое разнообразие, морфогенез, питательная среда
Введение. Современные достижения в области сельскохозяйственной биотехнологии создают огромный потенциал для науки и практики, позволяя не только эффективно размножать и оздоравливать растения, но и мобилизовать генетические ресурсы хозяйственно значимых видов и сортов. Особое значение приобретают методы in vitro культивирования, которые активно применяются как для массового размножения растений, так и для сохранения их генетического разнообразия [1, 2].
Сохранение генетического разнообразия растений реализуется в рамках двух основных стратегий: in situ – поддержание и восстановление жизнеспособных популяций в естественных условиях их обитания, и ex situ – сохранение компонентов биологического разнообразия вне их природных местообитаний [3]. Несмотря на преимущества сохранения генофонда в естественной среде, многие исследователи отмечают ряд проблем, таких как трудности доступа к растениям, влияние биотических (наводнения, пожары, засухи) и абиотических факторов [4], а также риск генетической эрозии в случае фрагментации местообитаний и сокращения численности популяций [5].
В связи с этим, сохранение ex situ считается наиболее эффективным и распространенным инструментом сохранения генетических ресурсов, особенно благодаря деятельности ботанических садов [6]. Среди методов ex situ наиболее эффективным считается хранение семян, однако его применение ограничено для видов с низким производством семян или плохой всхожестью [7].
Для вегетативно размножающихся видов традиционным подходом к сохранению является поддержание клоновых полевых коллекций, которые могут включать большое количество образцов, представляющих широкий спектр генетического разнообразия [8-11]. Однако данный метод имеет свои недостатки: ограниченная доступность качественного посадочного материала, а также, низкая эффективность размножения отдельных генотипов. Кроме того, поддержание полевых коллекций сопряжено с существенными экономическими затратами и риском потерь из-за биотических (патогены, вредители) и абиотических (почвенные или климатические факторы) стрессов. В связи с этим, особую актуальность приобретают альтернативные методы сохранения ex situ, включающие создание дублирующих коллекций, например, криобанков пыльцы и ДНК-депозитариев. Эти подходы не только минимизируют риски потери генетического материала, но и обеспечивают долгосрочное сохранение ценных генотипов с максимальной генетической стабильностью.
В настоящее время среди методов сохранения биоразнообразия ex situ центральное место занимает метод культивирования in vitro, позволяющий поддерживать жизнеспособность меристемных культур в контролируемых условиях в течение продолжительного времени. Данные культуры выполняют двойную функцию: служат стратегическим резервом ценного генофонда и одновременно представляют собой уникальный экспериментальный материал для проведения фундаментальных и прикладных исследований в области генетики, селекции и биотехнологии. Разработка методов сохранения растительного материала в коллекциях in vitro в течение длительного периода времени является важной задачей современной биотехнологии.
Возможность депонирования растительного материала изучалась многими учеными на протяжении нескольких десятилетий. В последние годы эти методики существенно усовершенствовались благодаря развитию новых технологий и углублению знаний в области молекулярной биологии, генетики и смежных дисциплин, что значительно расширило возможности их применения для различных групп растений. Успешно используются методы среднесрочного сохранения in vitro для овощных [9], декоративных [12, 13], плодовых и ягодных [14, 15], древесных культур [16], а также редких и исчезающих видов растений [17].
Методы сохранения культур in vitro в стерильных условиях на питательных средах, рассчитанные на период от нескольких месяцев до нескольких лет, определяются биологическими особенностями конкретных видов растений. Основные подходы включают модификацию условий культивирования путем снижения температуры и интенсивности освещения, а также введение в состав питательных сред специальных соединений, снижающих уровень метаболизма и как следствие замедляющих рост [9, 12–17]. Данные методические приемы обеспечивают эффективное сохранение генетического материала при одновременном сокращении трудозатрат на поддержание коллекций.
Эффективность и выбор конкретного метода сохранения in vitro зависят от ряда факторов. Растения, которые сохраняют генетическую стабильность в условиях in vitro, легко регенерируют из каллуса или тканей, лучше подходят для длительного хранения. Для среднесрочного сохранения лучше подходят виды устойчивые к низким температурам, осмотическому стрессу или ограничению питательных веществ. Медленно растущие растения (например, древесные или хвойные) лучше сохраняются in vitro, чем быстрорастущие виды. Таким образом, методы среднесрочного сохранения in vitro наиболее эффективны для растений, которые обладают высокой регенерационной способностью, устойчивостью к стрессу и медленным ростом.
Культивирование коллекций in vitro, как правило, сопряжено с рядом существенных ограничений, которые включают биологические риски (инфицирование микроорганизмами, генетическая нестабильность, сомаклональная изменчивость), технические сложности, а также значительные экономические затраты. Важным направлением минимизации этих недостатков может является оптимизация условий культивирования, в частности, за счет увеличения продолжительности межпассажных интервалов. Такой подход позволяет снизить частоту манипуляций с культурами, что уменьшает риск контаминации и трудовые затраты, одновременно способствуя поддержанию генетической стабильности за счет сокращения числа субкультивирований.
В Алтайском центре прикладной биотехнологии (АлтГУ, г. Барнаул) создана уникальная коллекция, насчитывающая более 60 генотипов хмеля – ценного технического растения. В собрание вошли как культурные сорта, так и дикорастущие формы, отобранные в ходе экспедиционных исследований из природных популяций юга Западной Сибири [18]. Коллекция представляет значительный интерес для селекционных программ и биотехнологических исследований.
Хмель (Humulus lupulus L.) – многолетняя лиана с отмирающими на зиму надземными побегами, характеризуется исключительно высокой скоростью ростовых процессов, достигающей в природных условиях 15–30 см в сутки. Эта биологическая особенность сохраняется при культивировании in vitro, что обусловливает необходимость частого (каждые 4–6 недель) пересаживания эксплантов на свежую питательную среду. Однако при длительном культивировании наблюдается сортоспецифичное снижение регенерационного потенциала: после 4–5 пассажей у отдельных генотипов отмечается уменьшение коэффициента размножения и эффективности регенерации [19]. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка специализированных протоколов, включающих оптимизацию состава питательных сред, и режимов культивирования для долгосрочного хранения генетического материала. Эти подходы позволяют минимизировать потерю морфогенетического потенциала при длительном поддержании коллекций хмеля in vitro.
Цель исследования – разработка эффективных биотехнологических приемов среднесрочного сохранения коллекционных образцов хмеля в условиях in vitro путем использования питательных сред, позволяющих увеличить продолжительность межпассажных периодов при сохранении жизнеспособности культур.
Объекты и методы. В качестве объекта исследования использовали стерильную культуру хмеля пяти сортов в фазе активного роста: Цивильский, Таурус, Флагман, Фаворит и Брянский. Перед депонированием образцы культивировали на питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащей 0,5 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК).
Эксперимент состоял из двух этапов. На первом этапе изучалось влияние 16 вариантов питательных сред (табл. 1) на развитие регенерантов сорта Цивильский. По результатам первого этапа были отобраны пять наиболее эффективных питательных сред, которые дополнительно протестировали на сортах Флагман, Таурус, Брянский и Фаворит.
Таблица 1
Состав питательных сред для среднесрочного сохранения хмеля
Composition of nutrient media for medium-term in vitro conservation of hops
|
Номер варианта |
Название |
Состав питательной среды |
|
1 |
MS1 |
MS + глюкоза 20 г/л (контроль) |
|
2 |
MS2 |
½ MS + глюкоза 20 г/л |
|
3 |
MS3 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + (Ca(NO3)2) 3,5 мг/л |
|
4 |
MS4 |
½ MS + глюкоза 40 г/л |
|
5 |
MS5 |
½ MS + маннит 10 г/л |
|
6 |
MS6 |
½ MS + маннит 20 г/л |
|
7 |
MS7 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + АБК 0,5 мг/л |
|
8 |
MS8 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + АБК 1 мг/л |
|
9 |
MS9 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + салициловая кислота 0,1 мг/л |
|
10 |
MS10 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + салициловая кислота 1 мг/л |
|
11 |
MS11 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + ССС 0,2 г/л |
|
12 |
MS12 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + ССС 0,4 г/л |
|
13 |
MS13 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + цефотаксим 100 мг/л |
|
14 |
MS14 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + канамицин 25 мг/л |
|
15 |
MS15 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + канамицин 50 мг/л |
|
16 |
MS16 |
½ MS + глюкоза 20 г/л + канамицин 100 мг/л |
Для контроля использовали безгормональную питательную среду MS (МS1). Оценивали влияние следующих компонентов в различных концентрациях: глюкозы, маннита, нитрата кальция (Ca(NO3)2), хлорхолинхлорида (ССС), салициловой кислоты, абсцизовой кислоты (АБК), канамицина, цефотаксима и уменьшения вдвое состава макро- и микроэлементов (МS2–МS16). В качестве основного источника углерода использовали глюкозу в концентрации 20 г/л, исключение составили питательные среды, где осмотическими агентами выступали повышенная концентрация глюкозы (MS4) или маннит (MS5, MS6).
Эксплантами служили одноузловые микрочеренки, отобранные из центральной части побега. Для каждого варианта эксперимента повторение составляло не менее 20 растений. В качестве культуральных сосудов использовали пробирки размером 200×21 мм с 15 мл питательной среды.
Растения культивировали в течение 12 мес. без проведения субкультивирования при стандартных условиях: температура в диапазоне 20–22 °C, фотопериод – 16 ч свет и 8 ч темнота, интенсивность освещения – 2 клк.
Согласно авторской методике [20] в ходе исследования фиксировали сроки достижения различных фаз развития: I фаза – формирование 2 пар настоящих листьев, II – 3–4 пар, III – 5–6 пар, IV – более 7 пар настоящих листьев. Срок фиксировался, при вступлении в него 70 % регенерантов. Через 2, 4, 6, 9 и 12 мес. беспересадочного культивирования регистрировали процент жизнеспособных растений, а также морфологические особенности развития.
Результаты и их обсуждение. Основной задачей депонирования является создание условий, способствующих снижению метаболической активности культур при условии сохранении их жизнеспособности. Для достижения этой цели могут применяться различные подходы, включая модификацию питательных сред. Действие различных компонентов на интенсивность ростовых процессов и сохранение жизнеспособности регенерантов хмеля было изучено на примере сорта Цивильский.
Экспериментальные данные демонстрируют, что введение в питательные среды определенных групп соединений (осмолитиков, ингибиторов роста, антибиотиков) достоверно снижает скорость и силу роста эксплантов, а также сроки вступления в соответствующие фазы развития (рис. 1, табл. 2).
Рис. 1. Высота регенерантов хмеля сорта Цивильский на разных фазах развития
Height of Tsivilsky hop regenerants at different stages of in vitro development
На контрольной питательной среде (МS1) растения хмеля демонстрировали максимальную скорость развития – регенеранты достигали IV фазы на 41-й день культивирования. Остальные среды в той или иной степени замедляли рост регенерантов. Пять сред не позволили растениям полноценно развиваться и достичь IV фазы (см. табл. 2).
Таблица 2
Динамика развития регенерантов хмеля сорта Цивильский
Dynamics of in vitro development of Tsivilsky hop regenerants
|
Питательная среда |
Сроки вступления в фазу развития, сут |
|||
|
I фаза |
II фаза |
III фаза |
IV фаза |
|
|
MS1 |
17 |
22 |
32 |
41 |
|
MS2 |
24 |
45 |
50 |
– |
|
MS3 |
17 |
28 |
40 |
55 |
|
MS4 |
24 |
39 |
43 |
55 |
|
MS5 |
17 |
28 |
47 |
68 |
|
MS6 |
48 |
52 |
– |
– |
|
MS7 |
13 |
17 |
36 |
45 |
|
MS8 |
22 |
30 |
42 |
52 |
|
MS9 |
22 |
27 |
34 |
53 |
|
MS10 |
20 |
29 |
39 |
47 |
|
MS11 |
22 |
36 |
51 |
65 |
|
MS12 |
17 |
38 |
43 |
58 |
|
MS13 |
17 |
28 |
39 |
53 |
|
MS14 |
26 |
40 |
59 |
– |
|
MS15 |
32 |
– |
– |
– |
|
MS16 |
42 |
63 |
– |
– |
Однако данный тип безгормональной среды не обеспечивал стабильности культуры, и высокая жизнеспособность сохранялась лишь в течение четырех месяцев (табл. 3), что указывает на непригодность среды МS1 для среднесрочного хранения.
Таблица 3
Жизнеспособность регенерантов хмеля сорта Цивильский при среднесрочном хранении, %
Viability of Tsivilsky hop regenerants during medium-term in vitro storage, %
|
Питательная среда |
Длительность пассирования, мес. |
||||
|
2 |
4 |
6 |
9 |
12 |
|
|
MS1 |
100,0 |
70,0 |
50,0 |
10,0 |
5,0 |
|
MS2 |
100,0 |
100,0 |
10,0 |
10,0 |
0 |
|
MS3 |
100,0 |
100,0 |
90,9 |
70,0 |
25,0 |
|
MS4 |
100,0 |
100,0 |
89,5 |
27,2 |
20,1 |
|
MS5 |
100,0 |
100,0 |
84,6 |
35,0 |
15,0 |
|
MS6 |
100,0 |
36,3 |
0 |
0 |
0 |
|
MS7 |
100,0 |
100,0 |
92,3 |
50,0 |
10,0 |
|
MS8 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
50,0 |
40,0 |
|
MS9 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
95,0 |
5,0 |
|
MS10 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
83,0 |
7,0 |
|
MS11 |
100,0 |
100,0 |
80,0 |
40,0 |
15,0 |
|
MS12 |
100,0 |
100,0 |
81,8 |
20,0 |
0 |
|
MS13 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
80,0 |
5,0 |
|
MS14 |
70,0 |
10,0 |
0 |
0 |
0 |
|
MS15 |
40,0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
MS16 |
70,0 |
50,0 |
0 |
0 |
0 |
Согласно литературным данным, использование разбавленных питательных сред (2–8-кратное разведение) является эффективным подходом к депонированию культур in vitro [15, 21]. Так, при культивировании эксплантов отдельных сортов груши на таких средах в течение 6 мес. Наблюдалась высокая жизнеспособность при низкой пролиферации, тогда как некоторые гибриды сохраняли жизнеспособность лишь до 4 мес. [15]. Эти результаты подчеркивают важность оптимизации условий депонирования для различных генотипов с учетом их специфики.
В нашем исследовании применение питательной среды MS2 с двукратно уменьшенной концентрацией минеральных компонентов, обеспечило значительное торможение ростовых процессов у хмеля в 1,4–2,0 раза по сравнению с контролем MS1 и лишь единичные экземпляры достигали IV фазы развития (см. рис. 1). Все регенеранты сохраняли жизнеспособность в течение 4 мес. (120 сут) культивирования, однако более длительное пассирование (свыше 6 мес.) вызывало гибель до 90 % образцов (см. табл. 3).
В исследованиях, проведенных Н.П. Дорошенко с соавторами, для создания беспересадочной коллекции винограда использовались модифицированные питательные среды, в которых дополнительно присутствовали ионы кальция [14]. Ионы Ca2+ играют ключевую роль в регуляции множества процессов в растениях, включая морфогенез, активацию защитных механизмов в ответ на воздействие факторов окружающей среды и патогенов, а также снижение окислительных повреждений при засухе за счет индукции антиоксидантной системы и взаимодействия с фитогормонами [22]. В качестве источников ионов кальция могут выступать такие соли, как хлорид или нитрат кальция, причем в ряде работ отмечено преимущество нитрата кальция перед хлоридом [12].
Использование питательной среды с нитратом кальция (MS3) продемонстрировало значительный эффект в среднесрочном сохранении культур хмеля in vitro. Введение данного компонента приводило к умеренному замедлению ростовых процессов (на 6–14 сут) по сравнению с контролем, что свидетельствует о его регуляторном влиянии на метаболизм растений. Ключевым преимуществом использования данной питательной среды явилось сохранение более 90 % жизнеспособных регенерантов в течение 6 мес., а 25 % оставались жизнеспособны до 12 мес. беспересадочного культивирования (см. табл. 3). Растения отличались развитой корневой системой, интенсивной зеленой окраской побегов, отсутствием признаков хлороза на листьях, что свидетельствует об оптимальном минеральном балансе и физиологической стабильности.
По опубликованным данным кальций часто используется как фактор, предотвращающий развитие стресса у растений. Например, в исследованиях, посвященных влиянию ионов кальция на культуры in vitro чая (Camellia sinensis L.) и медленнорастущей культуры гортензии (Hydrangea macrophylla Ser.), было выявлено, что избыток кальция в питательных средах приводит к уменьшению размеров листьев и замедлению кинетики роста. При этом присутствие экзогенного кальция помогает растениям справляться со стрессом, вызванным как длительным культивированием, так и осмотическим стрессом, например, при обогащении среды маннитом. Эти выводы подтверждаются данными биохимического анализа регенерантов, включая уровень содержания пролина и показатели перекисного окисления липидов [12, 13]. Таким образом, полученные в ходе эксперимента результаты позволяют рассматривать добавление нитрата кальция в состав питательной среды как перспективный подход для среднесрочного сохранения хмеля in vitro.
Среда MS4 отличалась увеличенной концентрацией глюкозы. Углеводы в питательных средах, помимо своей основной функции – источник энергии, оказывают существенное осмотическое воздействие на культивируемые растения, что, в свою очередь, имитирует условия умеренного водного дефицита, и как следствие, приводит к физиологическому замедлению ростовых процессов in vitro. Проведенные исследования на хмеле демонстрируют преимущество глюкозы перед традиционно применяемой в культуре клеток и тканей сахарозой [19]. Глюкоза как углеводный субстрат обеспечивает более эффективное энергоснабжение клеток, проявляет выраженное осморегулирующее действие, способствует поддержанию морфогенетического потенциала, оптимизирует метаболические процессы при длительном культивировании. Эти особенности делают глюкозу предпочтительным выбором для культивирования хмеля in vitro, особенно в контексте задач среднесрочного сохранения генетических ресурсов.
Увеличение концентрации глюкозы в питательной среде MS4 показало себя как эффективный способ снижения скорости развития хмеля in vitro на 7–14 сут по сравнению со контролем. После 12 мес. беспересадочного культивирования на среде MS4 сохранялось до 20 % жизнеспособных регенерантов. Эти результаты подтверждают перспективность использования глюкозосодержащих сред для среднесрочного хранения коллекционного хмеля.
Применение маннита в качестве углеродного источника в питательной среде MS5 показало выраженное ингибирующее действие на рост хмеля in vitro. Сахарный спирт в концентрации 10 г/л вызывал значительное замедление скорости морфогенеза – переход в IV фазу развития задерживался на 27 сут по сравнению с контролем. Однако длительное культивирование, свыше 5 мес., на такой среде приводило к постепенной потере жизнеспособности эксплантов (табл. 3). Увеличение концентрации маннита до 20 г/л (среда MS6) усиливало угнетающее действие на ростовые процессы, сроки образования морфологических структур для регенерантов существенно увеличились и высота растений во II фазе развития составила всего 1,3 см. Концентрация маннита в данной питательной среде оказалась чрезмерной для клеточного метаболизма, и после 4 мес. культивирования наблюдалась массовая гибель регенерантов (более 60 %). Выжившие растения демонстрировали признаки сильного стресса, хлорозные пятна и выраженный некроз тканей. Эти данные свидетельствуют, что маннит может использоваться для временного замедления роста хмелевых культур in vitro, однако его применение требует тщательного подбора концентрации и контроля сроков культивирования. Оптимальным представляется использование 10 г/л маннита для краткосрочного (до 4–5 мес.) сохранения коллекционного материала с последующим переводом на стандартные среды.
Использование ретардантов, таких как АБК и ССС, является распространенной практикой в культуре in vitro для контроля ростовых процессов. Согласно литературным данным, эти соединения доказали свою эффективность в регулировании развития растений [16, 17, 23, 24]. Абсцизовая кислота представляет особый интерес как природный регулятор роста, обладающий выраженным ингибирующим влиянием на процессы клеточного деления и растяжения, активизируя механизмы стрессоустойчивости растений, а также поддерживая жизнеспособность клеток в условиях in vitro.
Применение АБК (среды MS7 и MS8) в питательной среде продемонстрировало высокую эффективность для среднесрочного сохранения хмеля in vitro. Экспериментальные данные показали, что концентрация 1,0 мг/л АБК позволяет поддерживать жизнеспособность регенерантов на уровне 90–100 % в течение 6–7 мес. непрерывного культивирования. После 12 мес. культивирования сохраняется до 40 % жизнеспособных эксплантов, что является максимальным результатом для столь продолжительного периода (см. табл. 3). При этом АБК оказывает выраженное регулирующее действие на ростовые процессы, увеличивая сроки формирования характерных морфологических структур к IV фазе на 5–11 сут. по сравнению с контрольным вариантом. Такой эффект достигается благодаря комплексному физиологическому воздействию: активации стресс-адаптационных механизмов, ингибированию процессов клеточного деления и растяжения, а также стабилизации клеточных структур. Эти свойства делают АБК особенно ценным компонентом питательных сред для среднесрочного и долгосрочного сохранения генетических ресурсов хмеля in vitro. Важно отметить, что наблюдаемое замедление ростовых процессов не сопровождается потерей морфогенетического потенциала или снижением жизнеспособности культур. Напротив, растения демонстрируют хорошее физиологическое состояние и сохраняют способность к нормальному развитию после переноса на свежие питательные среды. При культивировании хмеля применение АБК позволяет не только замедлить ростовые процессы и увеличить межпассажные интервалы, но и повысить устойчивость эксплантов к стрессовым факторам, характерным для условий in vitro. Это особенно важно при среднесрочном и долгосрочном сохранении коллекционного материала. Это подтверждает перспективность использования АБК-содержащих сред в практике работы с коллекциями хмеля, особенно при необходимости длительного беспересадочного культивирования.
Положительное влияние АБК подтверждено в исследованиях при депонировании как древесных, так и травянистых культур. Например, показана возможность хранения культуры березы карельской (Betula pendula var. Carelica) в условиях in vitro в течение 12 мес. [25]. В работе по сохранению колокольчика жестколистного (Campanula sclerophylla) авторы предлагают использовать комплекс факторов, включающий ингибитор роста – АБК (2,0 мг/л), осмотик – сорбит (1,0 мг/л), низкую положительную температуру и неполный состав питательной среды МS [26].
Салициловая кислота – еще одно эндогенное фенольное соединение растений, регулирующее их рост и развитие, состояние антиоксидантной системы, процессы прорастания, фотосинтеза и созревания [27]. Например, при концентрации 0,14–1,0 мг/л салициловая кислота стимулировала корнеобразование у винограда (Vitis L.) а также оказывала ингибирующее воздействие на рост побегов [28]. При культивировании подвоев яблонь (Malus P. Mill.) добавление 3,0 мг/л салициловой кислоты в питательные среды тормозило рост корней на протяжении всего пассажа [29]. Кроме этого, отмечено, что высокие концентрации салициловой кислоты усиливают окислительный стресс в растениях [27]. Применение салициловой кислоты при среднесрочном хранении хмеля на средах MS9 и MS10 незначительно снижало рост побегов хмеля, при этом способствовало сохранению жизнеспособности регенерантов на уровне 80–95 % после 9 мес. Культивирования (см. табл. 3). У регенерантов после 10 мес. культивирования отмечалось отмирание верхушечной части побега.
Хлорхолинхлорид (ССС), как регулятор роста, проявляет свое действие через ингибирование синтеза гиббереллинов, что приводит к выраженному замедлению ростовых процессов, особенно на критических стадиях развития растений. Добавление этого ретарданта в питательные среды MS11 и MS12 существенно повышает уровень эндогенных ингибиторов роста, создавая условия для контролируемого снижения скорости развития in vitro. Среди применяемых ретардантов ССС в концентрации 0,4 г/л продемонстрировал наибольшую эффективность в замедлении кинетики роста и развития регенерантов хмеля. Так, переход в IV фазу развития наступал на 24 сут позже, чем в контрольном варианте. При этом, в течение 5 мес. культивирования наблюдалось 100 % сохранение жизнеспособности регенерантов. Дальнейшее увеличение сроков пассирования на средах MS11 и MS12 приводило к снижению жизнеспособности.
Аналогичные результаты были продемонстрированы в ряде работ и для других растений. У лука (Allium ivasczenkoae) комбинация ССС с повышенной дозой сахарозы позволила удлинить межпассажные интервалы, снизив жизнеспособность только до 80 % [17]. Применение 0,2–0,4 г/л ССС вместе с 60 г/л сахарозы для хризантемы (Chrysanthemum × morifolium) в 1,5 раза замедляло рост сохранив жизнеспособность на уровне 95–98 % [30]. В то же время, исследования с лавандой (Lavandula angustifolia Mill.) показали, что даже высокие концентрации ССС (200–400 мг/л) не обеспечивали достаточного эффекта и сопровождались значительной потерей жизнеспособности [31]. Эти данные подчеркивают видоспецифичность реакции растений на ретарданты и необходимость индивидуального подхода к разработке протоколов депонирования для каждой культуры.
Антибиотики нашли широкое применение в практике клонального микроразмножения растений, выполняя различные функции в зависимости от этапа культивирования и поставленных задач. Как свидетельствуют многочисленные исследования, эти соединения активно используются как для первичной стерилизации эксплантов [32], так и для химиотерапии инфицированного материала [33]. Примечательно, что в низких дозах антибиотики не только предотвращают бактериальную контаминацию [34], но и могут проявлять неожиданные стимулирующие свойства — от улучшения приживаемости микрочеренков аборигенных сортов винограда [35] до повышения регенерационной способности каллусных культур кукурузы [36] и березы карельской. Наряду с этим, исследователи предлагают использовать антибиотики в качестве ингибитора роста, что подтверждается успешным опытом длительного (7–10 мес.) хранения виноградных культур in vitro при добавлении гентамицина [33].
В ходе настоящего эксперимента антибиотики проявили выраженное влияние на ростовые процессы, однако их эффект оказался неоднозначным. Цефотаксим проявил себя как перспективный компонент питательных сред для среднесрочного хранения. В питательной среде MS13 этот антибиотик цефалоспоринового спектра способствовал увеличению срока вступления растений во II–IV фазы развития на 6–12 сут. Кроме этого, растения демонстрировали 100 % жизнеспособность в течение первых 6 мес. беспересадочного культивирования, сохраняя высокий уровень жизнеспособности к 9-му мес. пассирования (80 %). Полученные данные согласуются с результатами других исследований [35, 37], подтверждающие низкую фитотоксичность цефотаксима и его потенциал для использования в растительных биотехнологиях.
Напротив, при использовании питательных сред с канамицином (MS14–MS16) продемонстрирована выраженная фитотоксичность. Уже после 5 недель культивирования наблюдалась полная потеря жизнеспособности эксплантов, которые не могли сформировать более 5 междоузлий. Регенеранты, перешедшие во II и III фазы развития имели изменения в развитии в виде сильного хлороза нижних листьев, некроза стеблевой части и компенсаторного образования воздушных корней, что свидетельствует о глубоком нарушении физиологических процессов. После 5 мес. культивирования, все регенеранты погибали (см. табл. 3).
Эти контрастные результаты подчеркивают важность тщательного подбора типа и концентрации антибиотиков для каждой конкретной культуры. Если канамицин оказался непригодным для работы с хмелем из-за выраженного токсического действия, то цефотаксим способен замедлять ростовые процессы без существенного ущерба для жизнеспособности растений, что делает этот антибиотик перспективным компонентом для создания специализированных питательных сред.
Таким образом, для среднесрочного сохранения хмеля сорта Цивильский путем длительного, беспересадочного культивирования in vitro были выявлены наиболее перспективные питательные среды – МS3, МS4, МS5, МS8 и МS11. В дальнейшем была проведена оценка эффективности использования данных питательных сред для сохранения четырех перспективных сортов хмеля – Флагман, Таурус, Брянский и Фаворит. Результаты эксперимента выявили выраженные сортоспецифические различия в жизнеспособности регенерантов при длительном культивировании in vitro (рис. 2).
Рис. 2. Жизнеспособность регенерантов хмеля при среднесрочном культивировании in vitro:
А – Фаворит; Б – Брянский; В – Таурус; Г – Флагман
Viability of hop regenerants during medium-term storage in vitro:
A – Favorit; Б – Bryansky; В – Taurus; Г – Flagman
В течение 4 мес. беспересадочного культивирования на указанных средах сохранялось 100 % жизнеспособных регенерантов у трех сортов, за исключением сорта Таурус, у которого показатель снижался до 80 %. После культивирования хмеля на средах, содержащих ингибиторы роста на протяжении 6 мес. выживаемость регенерантов составляла 70–100 %, на контрольной среде MS1 – 20–40 %. Важно отметить, что дальнейшее культивирование свыше 6 мес. на среде MS1 приводило к гибели всех образцов. Эти данные убедительно подтверждают необходимость использования специализированных средовых композиций для длительного сохранения регенерантов хмеля in vitro.
Содержание культуры хмеля в условиях in vitro без субкультивирования в течение одного года позволило выделить среды, подходящие для среднесрочного сохранения. Все генотипы, показали высокий процент выживаемости на среде MS3 с добавлением нитрата кальция. Например, сорта Фаворит и Брянский сохраняли жизнеспособность в 95 % случаев (рис. 3). Культивирование хмеля сорта Таурус на данной среде в течение 12 мес. способствовало сохранению до 30 % жизнеспособного материала.
Рис. 3. Регенеранты хмеля (сорт Фаворит) через 12 месяцев среднесрочного сохранения
на различных питательных средах: А – MS3; Б – MS5; В – MS4
Hop regenerants (Favorit variety) after 12 months of medium-term storage on various nutrient media:
A – MS3; Б – MS5; В – MS4
Питательная среда MS4, содержащая 40 г/л глюкозы, поддерживала жизнеспособность сортов Фаворит, Брянский и Флагман на уровне 50–70 % при культивировании в течение 9 мес. При продлении срока пассирования до 1 года эффективность среды сохранялась лишь для сортов Фаворит и Флагман.
Использование среды MS5, содержащей 10 г/л маннита позволило сохранить большой процент жизнеспособных растений сортов Фаворит и Брянский (70 и 60 % соответственно), и 30 % жизнеспособных регенерантов сорта Флагман.
Применение среды MS8 с добавлением АБК обеспечивало высокий процент сохранности культур в течение 6-9 месяцев, и поддерживало жизнеспособность 40 % эксплантов сорта Брянский после годичного культивирования.
Для сорта Флагман выделялось три типа питательных сред MS3, MS4, MS11, при культивировании на которых, выживаемость эксплантов через 12 мес. беспересадочного пассирования варьировала от 50 до 60 %.
Полученные результаты подчеркивают необходимость учета сортоспецифичных реакций регенерантов in vitro, что особенно актуально для создания коллекций, включающих широкий спектр генотипов хмеля.
Заключение. Проведенное исследование позволило разработать эффективные биотехнологические приемы среднесрочного сохранения коллекционных образцов хмеля in vitro. Оптимизация состава питательных сред обеспечила значительное увеличение межпассажных интервалов при сохранении высокой жизнеспособности культур.
Исследование выявило сортоспецифичность реакций хмеля при длительном культивировании. Наиболее устойчивые показатели развития демонстрировали сорта Фаворит и Брянский, тогда как Таурус проявлял повышенную чувствительность к химическим модификациям среды и отличался низкой способностью к длительному культивированию.
Наибольшую результативность продемонстрировала среда, обогащенная 3,5 мг/л нитратом кальция (Ca(NO3)2), которая поддерживала жизнеспособность регенерантов сортов Фаворит и Брянский на уровне 95 % даже после 12 мес. культивирования.
Абсцизовая кислота в концентрации 1 мг/л проявляла комплексное регуляторное действие и обеспечивала 90–100 % сохранность культур в течение 6–7 мес. при хороших морфологических показателях, а у сортов Цивильский и Брянский после годичного культивирования поддерживалась жизнеспособность 40 % эксплантов.
В то же время применение маннита и хлорхолинхлорида (ССС) показало ограниченную эффективность, сильно зависящую от концентрации и сортовых особенностей.
Антибиотики проявили неоднозначное действие: цефотаксим подтвердил свою перспективность, тогда как канамицин оказался фитотоксичным и приводил к гибели регенерантов хмеля. Цефотаксим в дозировке 100 мг/л, демонстрируя умеренное ингибирующее действие при минимальной фитотоксичности, показал себя как перспективный регулятор роста. Его применение позволило сохранить 80 % жизнеспособных эксплантов сорта Цивильский в течение 9 мес., что делает данный антибиотик ценным компонентом для среднесрочного хранения коллекционного материала.
Разработанные протоколы питательных сред позволяют сохранять перспективные генотипы хмеля in vitro до 12 мес. в беспересадочной культуре, что имеет важное значение для создания биотехнологических коллекций, снижения трудозатрат и коммерческого применения технологии клонального микроразмножения.
1. Kaya E. Importance of Plant Biodiversity and longterm Conservation of Plant Genetic Resources via Biotechnological Strategies // Journal of Biosciences and Medicines. 2024. Vol. 12. P. 584–591. DOI:https://doi.org/10.4236/jbm.2024.1211044.
2. Benelli C., Tarraf W., Izgu T., et al. In Vitro Conservation through Slow Growth Storage Technique of Fruit Species: An Overview of the Last 10 Years // Plants. 2022. Vol. 11. P. 3188. DOI:https://doi.org/10.3390/plants11233188.
3. Конвенция о биологическом разнообразии: принята в г. Рио-де-Жанейро 05.06.1992. Доступно по: https://cbd.int/convention/text. Ссылка активна на 25.07.2025.
4. Хлесткина Е.К., Чухина И.Г. Генетические ресурсы растений: стратегия сохранения и использования // Вестник Российской академии наук. 2020. Т. 90, № 6. С. 522–527. DOI:https://doi.org/10.31857/S 0869587320060043.
5. Bosse M., van Loon S. Challenges in quantifying genome erosion for conservation // Front. Genet. 2022. Vol. 13. Art. 960958. DOI:https://doi.org/10.3389/fgene.2022.960958.
6. Gorbunov Yu.N., Kuzevanov V.Ya. The Role of Russian Botanical Gardens in plant biodiversity conservation. In: Botanical Gardens and their role in plant conservation. European and American Botanical Gardens. Vol. 3. CRC Press., 2023. P. 63–89. DOI:https://doi.org/10.1201/9781003282556-4.
7. Швачко Н.А., Хлесткина Е.К. Молекулярно-генетические основы устойчивости семян к окислительному стрессу при хранении // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020. Т. 24, № 5. С. 451–458. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ20.47-o.
8. Сорокопудова О.А., Артюхова А.В. К организации полевых коллекций многолетних травянистых растений во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства // Плодоводство и ягодоводство России. 2018. Т. 55. С. 208–212.
9. Овэс Е.В., Гаитова Н.А., Шишкина О.А. Сохранение сортовых ресурсов картофеля в полевой и in vitro коллекциях Федерального исследовательского центра картофеля им. А.Г. Лорха // Биотехнология и селекция растений. 2022. Т. 5, № 1. С. 28–41. DOI:https://doi.org/10.30901/2658-6266-2022-1-o5.
10. Осипова Ю.С., Леонтьева В.В., Дементьев Д.А. Оценка сортов коллекции хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) по хозяйственно важным признакам // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2022. Т. 23, № 2. С. 194–202. DOI:https://doi.org/10.30766/2072-9081.2022.23.2.194-202.
11. Никонова З.А., Короткова З.П. Создание и сохранение коллекции хмеля обыкновенного в качестве генофонда для селекции // Нива Поволжья. 2017. № 4. С. 104–108. DOI: 10.24412/ feqwlgnakhy.
12. Малюкова Л.С., Конинская Н.Г. Влияние кальция на физиолого-биохимические параметры гидрангеи крупнолистной (Hydrangea macrophylla Ser.) в медленнорастущей культуре in vitro // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2020. № 66 (6). С. 270–283. DOI:https://doi.org/10.30679/2219-5335-2020-6-66-270-283.
13. Нечаева Т.Л., Зубова М.Ю., Малюкова Л.С., и др. Адаптация in vivo и in vitro растений Camellia sinensis (L.) Kuntze к действию кальция // Субтропическое и декоративное садоводство. 2021. № 78. С. 66–76. DOI:https://doi.org/10.31360/2225-3068-2021-78-66-76.
14. Дорошенко Н.П. Модификация питательной среды для депонирования винограда in vitro // Русский виноград. 2017. Т. 6. С. 8–16.
15. Ташматова Л.В., Высоцкий В.А., Джафарова В.Е. Клональное микроразмножение и депонирование груши in vitro. Орел: ВНИИСПК, 2015. 18 с.
16. Шабанова Е.А., Внукова Н.И., Машкина О.С. Влияние модификаций состава питательных сред на эффективность длительного хранения in vitro клонов тополя и осины // Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация». 2020. № 1. С. 42–49.
17. Силантьева М.М., Мироненко О.Н., Овчарова Н.В., и др. Фитоценотическая приуроченность хмеля обыкновенного на юге Западной Сибири // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2024. Т. 185, № 4. С. 20–31. DOI:https://doi.org/10.30901/2227-8834-2024-4-20-31.
18. Гашенко О.А., Кастрицкая М.С., Кухарчик Н.В. Микроразмножение сортов хмеля в культуре in vitro // Субтропическое и декоративное садоводство. 2019. № 68. С. 111–118. DOI: 10.31360/ 2225-3068-2019-68-111-118.
19. Мякишева Е.П., Бычкова О.В., Мироненко О.Н. Новые элементы оценки морфогенеза регенерантов хмеля in vitro // Аграрный научный журнал. 2024. № 5. С. 40–46. DOI:https://doi.org/10.28983/asj. y2024i5pp40-46. EDN: https://elibrary.ru/UGXNVZ.
20. Иванова Н.Н., Корзина Н.В., Цюпка В.А., и др. Влияние условий сохранения in vitro на жизнеспособность и генетическую стабильность садовых растений // Таврический вестник аграрной науки. 2024. № 2. С. 53–66. DOI:https://doi.org/10.5281/zenodo.12178658.
21. Negi N.P., Prakash G., Narwal P., et al. The calcium connection: exploring the intricacies of calcium signaling in plant-microbe interactions // Front. Plant Sci. 2023. Vol. 14. Art. 1248648. DOI:https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1248648.
22. Kumar S., Shah S., Vimala Y., et al. Abscisic acid: Metabolism, transport, crosstalk with other plant growth regulators, and its role in heavy metal stress mitigation // Frontiers in Plant Science. 2022. Vol. 13. Art. 972856. DOI:https://doi.org/10.31857/S0006813620030072.
23. Круглова Н.Н., Сельдимирова О.А., Зинатуллина А.Е., и др. Абсцизовая кислота в системах культуры in vitro эксплантов // Известия Уфимского научного центра РАН. 2018. № 2. С. 55–60. DOI:https://doi.org/10.31040/2222-8349-2018-0-2-55-60.
24. Концевая И.И. Эффект абсцизовой кислоты при депонировании карельской березы в культуре in vitro // Бюллетень науки и практики. 2018. Т. 4, № 7. С. 11–16.
25. Маляровская В.И., Шуркина Е.С. Влияние факторов культивирования на длительность депонирования in vitro эндемичного вида Campanula sclerophylla Kolak. // Субтропическое и декоративное садоводство. 2022. № 81. С. 98–106. DOI:https://doi.org/10.31360/2225-3068-2022-81-98-106.
26. Лубянова А.А., Безрукова М.В., Шакирова Ф.М. Взаимодействие сигнальных путей при формировании защитных реакций растений в ответ на стрессовые факторы окружающей среды // Физиология растений. 2021. Т. 68, № 6. С. 563–578.
27. Дорошенко Н.П., Пузырнова В.Г. Способы замедления ростовых процессов для создания коллекции генофонда винограда in vitro // Субтропическое и декоративное садоводство. 2024. № 88. С. 102–122. DOI:https://doi.org/10.31360/2225-3068-2024-88-102-122.
28. Шапорева В.А., Змушко А.А., Колбанова Е.В. Влияние салициловой кислоты на ризогенез растений-регенерантов подвоев яблони в культуре in vitro // Весці Нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. Серыя біялагічных навук. 2017. № 4. С. 75–80.
29. Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Митрофанова О.В., и др. Особенности депонирования хризантемы садовой в условиях in vitro // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. 2019. № 131. С. 110–117.
30. Егорова Н.А., Ставцева И.В., Коваленко М.С. Длительное хранение сортов лаванды в культуре in vitro при использовании питательных сред разного состава // Таврический вестник аграрной науки. 2024. № 3. DOI:https://doi.org/10.5281/zenodo.13782781.
31. Сухопаров А.А., Лебедев А.Н., Темиров К.С. Влияние различных способов стерилизации эксплантов гороха при введении в культуру in vitro // Международный научно-исследовательский журнал. 2023. № 11. С. 56–61. DOI:https://doi.org/10.23670/IRJ.2023.137.56.
32. Дорошенко Н.П., Жукова Т.В. Совместное применение антибиотиков гентамицин и цефотаксим при культивировании винограда in vitro // Русский виноград. 2015. Т. 1. С. 67–71.
33. Tewelde S., Patharajan S., Teka Z., et al. Assessing the efficacy of broad‐spectrum antibiotics in controlling bacterial contamination in the in vitro micropropagation of ginger (Zingiber officinale Rosc.) // The Scientific World Journal. 2020. Vol. 2020. Art. 6431301. DOI:https://doi.org/10.1155/2020/6431301.
34. Дорошенко Н.П., Ребров А.Н., Трошин Л.П. Биотехнология оздоровления и сохранения аборигенных донских сортов винограда // Научный журнал КубГАУ. 2019. № 154. С. 327–345. DOI:https://doi.org/10.21515/1990-4665-154-031.
35. Концевая И.И. Применение антибиотиков для оптимизации микроразмножения Betula pendula var. carelica Merckl. // Бюллетень науки и практики. 2018. Т. 4, № 5. С. 68–73.
36. Verhaegen M., Bergot T., Liebana E., et al. On the use of antibiotics to control plant pathogenic bacteria: a genetic and genomic perspective // Front. Microbiol. Vol. 14. Art. 1221478. DOI: 10.3389/ fmicb.2023.1221478.
