Россия
Новый поселок, Республика Татарстан, Россия
Россия
Цель исследования – анализ локализации дрожжеподобных грибов рода Candida в ротовой полости и желудочно-кишечном тракте у крупнорогатого скота. Отбор материала проводили в АО «Елабужский мясоконсервный комбинат» Республики Татарстан в период с мая по июль 2021 г. Исследованию подвергались туши дойных коров в возрасте 4–5 лет с признаками грибкового заболевания желудочно-кишечного тракта. Визуальный осмотр и скрининг органов ротовой полости, желудочно-кишечного тракта были проведены ветеринарными специалистами согласно «Правилам ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 27.12.1983 г., с изменениями и дополнениями от 17.06.1988 г.). Лабораторные исследования туш крупнорогатого скота на наличие инфекционных агентов проводили согласно «Порядку санитарно-микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов» (утв. Департаментом пищевой и перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода России 15.12.1995 г.). Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что возбудители микозов Candida albicans являются постоянными обитателями полости рта, желудочно-кишечного тракта (сычужный отдел, сетка, книжка, толстый и тонкий отделы кишечника) у КРС. Только ранняя диагностика, своевременное лечение и устранение условно-патогенных микроорганизмов позволяет сохранить поголовье молочно-продуктивных коров и предотвратить угрозу развития и распространения кандидозного эндометрита.
сельскохозяйственные животные, Candida albicans, дрожжевые грибы, эндометриты
Введение. Грибы рода Candida albicans патогенны и способны поражать кожу, поверхность слизистых оболочек, в дальнейшем вызывая обширную инфекцию в организме сельскохозяйственных животных [1–3]. Candida albicans присутствуют при 400 000 системных грибковых заболеваниях, вызывая около 70 % грибковых инфекций во всем мире [4, 5]. Микрофлора ротовой полости представляет совокупность различных таксономических групп микроорганизмов и мицелиальных грибов, контаминирующих ротовую полость животных как своеобразную экологическую нишу организма, участвующих в биохимических, иммунологических взаимодействиях с макроорганизмами [6–8]. Стабильная микрофлора ротовой полости животных образовалась вследствие взаимных симбиотических вариантов организма и микробов. Взаимосвязанные приспособительные изменения приводят к биологическому «равновесию» между организмом и микробной флорой, в том числе и между составляющими ее видами [9]. Ученые предполагают, что дрожжевой гриб C. аlbicans может напрямую влиять на микробную экологию и увеличивать кариесогенность биопленок полости рта, таким образом провоцируя развитие корневого кариеса [8]. Дрожжевой гриб C. albicans обладает уникальной способностью к трансформации – переходить из состояния дрожжей в гифы, что может помочь грибам избежать стадии фагоцитоза макрофагов, способствует увеличению вероятности внедрения в ткани хозяина и нанесению большого ущерба для здоровья животного [10]. Постоянный механизм роста гиф дрожжевого гриба, разрастание и поддержание ультрасовременной полярности и факторов вирулентности вызывают серьезную инфекцию у живого организма.
Цель исследования – анализ локализации дрожжеподобных грибов рода Candida в ротовой полости и желудочно-кишечном тракте у крупнорогатого скота.
Материалы и методы. Отбор материала проводили в АО «Елабужский мясоконсервный комбинат» Республики Татарстан в период с мая по июль 2021 г. Исследованию подвергались туши дойных коров в возрасте 4–5 лет с признаками грибкового заболевания желудочно-кишечного тракта.
Визуальный осмотр и скрининг органов ротовой полости, желудочно-кишечного тракта были проведены ветеринарными специалистами согласно «Правилам ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 27.12.1983 г., с изменениями и дополнениями от 17.06.1988 г.).
Лабораторные исследования туш крупнорогатого скота на наличие инфекционных агентов проводили согласно «Порядку санитарно-микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов» (утв. Департаментом пищевой и перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода России 15.12.1995 г.).
Особое внимание уделяли случаям, где слизистая ротовой полости была покрыта белым налетом в виде пленки. При скрининге слизистой пищевода обнаруживали покрытие полости толстым белым налетом, который легко снимался пластиковыми шпателями. Во многих случаях наблюдалось характерное катарально-геморрагическое воспаление; в желудке и на его стенках под серовато-желтой пленкой обнаруживали гиперемию слизистой оболочки; в тонком отделе кишечника – слизистая оболочка утолщена, набухшая, отечная, гиперемированная с кровоизлияниями и покрыта творожисто-подобными наложениями или слизью; пейеровы бляшки и солитарные фолликулы увеличены; слизистая оболочка толстого отдела набухшая с белым рыхлым налетом (под ним кровоизлияния и изъявления), иногда покрыта слизью, фибринозными пленками с некротическими участками.
Выделение дрожжевых и мицелиальных грибов проводили на питательных средах Сабуро. Для определения общего числа грибов в желудочно-кишечном содержимом готовили суспензию путем внесения одного грамма влажного образца в 10 мл дистиллированной воды с температурой 35 °С, с последующим взбалтыванием в течение 10 мин при 160 об/мин. Далее готовили серию 10-кратных разведений полученной суспензии, чтобы получить разведения 1:10, 1:100, 1:1000. С каждого разведения по 1 мл переносили в чашки Петри с агаризированной питательной средой. Для уточнения характера заболевания осуществляли микроскопию тканей с разрезов лимфоузлов, фрагментов творожистых наложений со слизистых оболочек с окраской гематоксилин-эозином или генцианвиолетом. Забор материала со слизистых оболочек осуществляли стерильными ватными тампонами при помощи пластиковых шпателей. Посев производили на агаризированную среду Сабуро, содержащую 2 %-ю глюкозу и хлорамфеникол. Чашки Петри инкубировали при 35 °С в течение 4 сут, ежедневно просматривая их. При появлении роста микроорганизмов проводили микроскопию по Граму. Выделение кишечных микроорганизмов проводили на специальных средах МПА (мясо-пептонный агар) и среде Эндо.
Образцы смывов из ротовой полости и желудочно-кишечного содержимого исследовали в трех повторностях, соблюдая условия асептики и антисептики, во избежание контаминации. Посевы инкубировали при 35 °С в течение 2–7 сут. Влажность в термостате определялась по психрометру Августа, составляла от 82 до 83 % за весь период инкубации. Подсчет дрожжевых грибов проводили визуально с каждой чашки. ОЧГ грибов вычисляли по формуле
где x – суммарное число грибов, выраженное количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г продукта; Σс – сумма колоний на всех чашках, подсчитываемая в посевах всех трех последовательно разведенных взвесей; V1 – объем взвеси 1 (разведение 10-1); V2 – объем взвеси 2 (разведение 10-2); V3 – объем взвеси 3 (разведение 10-3).
Выделение чистой культуры гриба проводили методом непосредственного пересева выросших колоний.
Инкубацию изолятов проводили в термостате, учитывая температуру и влажность, как описано выше. Идентификацию выросшей культуры гриба проводили при помощи атласов.
При микроскопии препарата использовали пастеровские пипетки. Визуально выбранный участок конидии штрихом от центра к краю помещали в каплю дистиллированной воды на предметное стекло. Споры изолятов промывали с добавлением этилового спирта (соотношение 1:1). Мицелий покрывали покровным стеклом и проводили микроскопическое исследование при 10-кратном и 40-кратном увеличении. Идентификацию грибов проводили по морфологическим признакам, которые сопоставляли с таковыми в определителе грибов (Watanabe 2010), а также с нашей многолетней фотоколлекцией грибов.
Результаты и их обсуждение. При взятии проб учитывались органолиптические показатели, такие как цвет и запах секрета (табл. 1). Смывы с ротовой полости и содержимого желудочно-кишечного тракта дойных коров, поступивших на АО «Елабужский мясоконсервный комбинат», проводились по правилам асептики и антисептики (табл. 2). При визуальном осмотре коров наблюдалось увеличение лимфатических узлов в области брыжейки и сычуга. Брыжеечные лимфатические узлы располагались в виде цепи из большого количества узелков. Для уточнения заболевания проводили микроскопию тканей с разрезов лимфоузлов, фрагментов творожистых наложений со слизистых оболочек с окраской генцианвиолетом.
Оценку токсичности отобранных проб проводили биотестированием на инфузориях.
Таблица 1
Показатели рН, органолептика и биотестирование содержимого желудка
|
Номер пробы |
Консистенция пробы |
Запах пробы |
Температура пробы при исследовании, ºС |
рН |
Токсичность на инфузориях Paramecium caudatum |
|
1 |
Однородная масса с растительными включениями |
Травяной |
18,9 |
7,48 ± 0,20 |
Проба нетоксична |
|
2 |
Однородная, с растительными включениями |
Травяной |
17,6 |
7,06 ± 0,20 |
Проба нетоксична |
|
3 |
Однородная, с растительными включениями |
Травяной |
19,1 |
7,53 ± 0,20 |
Проба нетоксична |
|
4 |
Однородная, с растительными включениями |
Травяной |
18,9 |
7,83 ± 0,20 |
Проба нетоксична |
|
5 |
Твердая, комкообразная |
Затхлый |
19,6 |
6,44 ± 0,20 |
Проба слаботоксична |
Таблица 2
Микрофлора ротовой полости у животных
|
Номер пробы |
ОЧГ (КОЕ/г) изолятов |
Выделенные изоляты грибов |
Выделенные микроорганизмы |
|
Смывы с ротовой полости |
|||
|
1 |
1,8∙106 |
Candida albicans |
Streptococcus, Leptotrichia |
|
2 |
1,2∙106 |
Candida albicans, Mucor sp. |
Staphylococcus, Porphyromonas |
|
3 |
1,1∙106 |
Candida albicans, Mucor sp. |
Bacteroides, Staphylococcus, |
|
4 |
1,4∙106 |
Candida albicans Mucor sp. |
Porphyromonas, Streptococcus |
|
5 |
1,7∙106 |
Candida albicans |
Prevotella, Staphylococcus, |
|
Содержание бактерий и грибов в желудочно-кишечных смывах |
|||
|
1 |
2,1∙106 |
Candida albicans |
Streptococcus spp. |
|
2 |
2,7∙106 |
Candida albicans, Mucor sp. |
Streptococcus spp., Proteus vulgaris. |
|
3 |
1,9∙106 |
Candida albicans |
Streptococcus spp., E coli |
|
4 |
2,4∙106 |
Candida albicans, Mucor sp. |
Streptococcus spp., E. сoli, F. necrophorum |
|
5 |
2,9∙106 |
Candida albicans, Trichoderma sp. |
Streptococcus spp. |
В исследовании смывов из ротовой полости коров на наличие микробных изолятов выделялись аэробные и анаэробные микроорганизмы: Streptococcus, Leptotrichia Bacteroides, Staphylococcus, Porphyromonas.
Результаты исследования смывов из ротовой полости животных на агаризированных средах представлены на рисунках 1, 2.
|
Рис. 1. На агаризированных средах со смывов из ротовой полости выделялся изолят C. albicans |
Рис. 2. На агаризированных средах со смывов из ротовой полости выделялись изоляты C. albicans и Mucor sp. |
При лабораторном скрининге отобранного материала дрожжевые грибы Candida albicans были зафиксированы в ротовой полости (32 %), сычужном отделе (29 %), сетке и книжке (19 %), толстом и тонком отделах кишечника (22 %). При исследовании содержимого сычуга, сетки и книжки на среде Сабуро были выделены грибы рода Candida. Лабораторные исследования показали (см. табл. 1), что при оценке токсичности пятая проба оказалась слаботоксичной (рН 6,44±0,20), а с первой по четвертую пробы были нетоксичны (рН от 7,06±0,20 до 7,83±0,20). При анализе смывов микрофлоры ротовой полости у животных (см. табл. 2) во всех пробах были выделены дрожжевые грибы Candida albicans (общее число грибов составило от 1,1∙106 до 1,8∙106). В пробах со второй по четвертую были выделены изоляты грибов Mucor sp. В желудочно-кишечных смывах обнаружено содержание бактерий Streptococcus spp., Streptococcus spp., Proteus vulgaris, Streptococcus spp., E coli, Streptococcus spp., E. сoli, F. Necrophorum, Streptococcus spp. и грибов Candida albicans, где ОЧГ составило от 1,9∙106 до 2,9∙106, причем во второй и четвертой пробах были выделены изоляты грибов Mucor sp, в пятой пробе – полевой изолят Trichoderma sp.
Заключение. Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что возбудители микозов Candida albicans являются постоянными обитателями полости рта, желудочно-кишечного тракта (сычужный отдел, сетка, книжка, толстый и тонкий отделы кишечника) у КРС. Только ранняя диагностика, своевременное лечение и устранение условно-патогенных микроорганизмов позволяют сохранить поголовье молочно-продуктивных коров и предотвратить угрозу развития и распространения кандидозного эндометрита.
1. Baillie G.S., Douglas J.L. Role of dimorphism in the development of Candida albicans biofilms // Journal of Medical Microbiology. 1999. № 48 (7). P. 671–679.
2. The changing epidemiology of invasive fungal infections / D.A. Enoch [et al.] // Methods in Molecular Biology. 2017. № 1508. P. 17–65.
3. Antifungal benzo[b]thiophene 1,1-dioxide IMPDH inhibitors exhibit pan-assay interference (PAINS) profiles / L.K. Kummari [et al.] // Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2018. № 26 (20). P. 5408–5419.
4. Biodiversity of myceltal fungi in freshwater in the territory of the park «Mari Chodra» of the Russian Federation / R.M. Potekhina [et al.] // Systematic Reviews in Pharmacy. 2020. № 11 (12). P. 1464–1472.
5. Effect of 2, 4-di-tert-butylphenol on growth and biofilm formation by an opportunistic fungus Candida albicans / A.R. Padmavathi [et al.] // Biofouling. 2015. № 31 (7). P. 565–574.
6. Comparative toxicity assessment of soil fungi isolated from Black sea coasts / R.M. Potekhina [et al.] // BioNanoScience. 2020. № 10(3). P. 799–806.
7. Candida albicans dimorphism as a therapeutic target / I.D. Jacobsen [et al.] // Expert Review of Anti-Infective Therapy. 2012. № 10 (1). P. 85–93.
8. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms / G. Ramage [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001. № 45 (9). P. 2475–2479.
9. Effect of the echinocandin caspofungin on expression of Candida albicans secretory aspartyl proteinases and phospholipase in vitro / J.-S. Ripeau [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. № 46 (9). P. 3096–3100.
10. Successful treatment with caspofungin of candiduria in a child with Wilms tumor; review of literature / M.S. Rezai [et al.] // Journal de Mycologie Medicale, 2017. № 27 (2). P. 261–265.
