Введение. Выращивание растений в условиях in vitro влечет за собой ряд морфофизиологических и биохимических изменений в условиях очень высокой влажности воздуха, низкой освещенности, постоянной температуры, очень низкой турбулентности воздуха. Зачастую отмечается недостаточная концентрация CO2, зависящая от источников углерода, регуляторов роста и водного потенциала питательной среды, этилена и других летучих веществ и т. д. К тому же условия могут меняться от типа сосуда и степени его закупорки. В связи с этим адаптация к септическим условиям и акклиматизация регенерантов требует большего внимания, чем растения, выращенные в естественных условиях [1, 2].
После переноса в условия ex vitro растениям требуется некоторое время, чтобы «исправить» аномалии, вызванные культивированием in vitro [3, 4]. Растения должны перестроиться со смешанного, а зачастую гетеротрофного типа питания на автотрофный. Помимо этого происходит адаптация фотосинтетического аппарата. Для стабилизации водного баланса и эффективной регуляции транспирации необходимо развитие кутикулы, эпикутикулярного воска и повышение функциональности устьичного аппарата. Как правило, корневая система, сформированная в условиях in vitro, характеризуется отсутствием корневых волосков и корней второго порядка [5]. В связи с этим для успешного роста и развития необходимо новообразование корней, имеющих характерное морфологическое строение интактных растений.
Таким образом, на последнем, ключевом этапе микроразмножения для растений-регенерантов необходимо создание условий, при которых они смогут перестроиться к внезапным изменениям условий окружающей среды для дальнейшего полноценного роста и развития.
Большинство растений адаптируют в теплицах, подбирая оптимальный субстрат (органический, минеральный или смешанный), дозы обработки фунгицидами, поскольку повышенная влажность в начале адаптации ведет к бурному развитию грибков на растениях и поверхности субстрата, дополнительно проводят обработку абсцизовой кислотой и/или обогащают CO2 и т. д. [6]. В качестве альтернативы ряд исследователей предлагает использование гидропонной установки на этапе адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro [5, 7, 8]. Замена субстрата жидкой средой и автоматический режим освещения и контроля подачи питательного раствора обеспечивают высокую производительность при создании больших объемов посадочного материала. Разные эколого-морфологические характеристики культур обусловливают необходимость индивидуального подбора условий адаптации.
Хмель обыкновенный (Humulus lupulus L.) является мезогигрофитной многолетней травянистой лианой, которая культивируется как эфирномасличная, техническая и лекарственная культура. В производственных целях сорта размножают вегетативно, и усовершенствование технологических процессов производства саженцев является очень актуальным.
Цель исследования – отработка схемы двухступенчатой адаптации растений-регенерантов хмеля обыкновенного к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки.
Задачи: изучение влияния способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе; определение длительности этапа адаптации на гидропонике; подбор состава субстрата на втором этапе адаптации.
Объект и методы. Объектом служила стерильная культура хмеля обыкновенного трех сортов: Цивильский, Флагман и Таурус, после завершения этапа укоренения in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащей глюкозу (20 г/л) и ИМК (0,5 мг/л). Адаптация растений-регенерантов проходила в два этапа, на первом использовали гидропонную установку приливно-отливного типа. Растения отмывали от агара в дистиллированной воде (рис. 1, А) и закрепляли в кассеты с полиэтиленовыми вкладышами без субстрата (рис. 1, Б) либо помещали в рассадные кассеты объемом 95–120 мл с субстратом из перлита и агровермикулита (1 : 1) (рис. 1, В). Для поддержания повышенной влажности первые 5–7 сут растения укрывали прозрачной полиэтиленовой пленкой. Гидропонную установку заправляли питательным раствором по прописи ¼ МS, модифицированной по содержанию KH2PO4, рН раствора контролировали ежедневно. Режим подачи раствора: 5 мин подача, 20 мин перерыв. Освещение в режиме 16 ч день / 8 ч ночь. Окончание этапа определяли по совокупности двух показателей: стойкое поддержание тургора листьями и интенсивный рост побегов. По завершении этапа на гидропонной установке оценивали следующие параметры: количество побегов 1-го и 2-го порядков (шт.), высота главного побега (см), количество корней (шт.), средняя длина корней (см).
Рис. 1. Регенеранты H. lupulus L. на гидропонной установке:
А – после укоренения in vitro перед высадкой; Б – высаженные в кювету
с полиэтиленовыми вкладышами; В – высаженные в рассадные кассеты
На втором этапе адаптации растения пересаживали в рассадные горшки объемом 500 мл с заранее подготовленными и простерилизованными субстратами. Оценивали 10 вариантов субстрата следующего состава (в скобках указаны объемные доли): 1 – чернозем; 2 – верховой торф Klassman TS1 (торф I); 3 – чернозем : перлит (3 : 1); 4 – чернозем : песок речной (3 : 1);
5 – чернозем : перегной (3 : 1); 6 – торф I : перегной (3 : 1); 7 – торф I : песок (3 : 1); 8 – торф I : перлит (3 : 1); 9 – чернозем : торф верховой раскисленный Сибирский «БиоМастер» (торф II) : перлит (1 : 1 : 1); 10 – торф I : чернозем : перегной : песок (3 : 3 : 1 : 1). Горшки размещались в вегетационной комнате с досвечиванием в режиме 16 ч день / 8 ч ночь. Полив осуществлялся по мере подсыхания земляного кома. Визуальную оценку проводили спустя 3 недели: оценивали развитие корневой системы, формирование корневого кома, количество побегов, рассчитывали среднюю высоту побегов.
Результаты и их обсуждение. Перед началом адаптации высота регенерантов хмеля in vitro независимо от сорта составляла 13,8–14,6 см. Мериклоны имели сформированную корневую систему и развитую систему побегов в количестве от 1 до 3 с 6–7 узлами (рис. 2).
Рис. 2. Высота побегов хмеля обыкновенного до и после адаптации
на гидропонной установке: А – в рассадных кассетах;
Б – в кюветах с полиэтиленовыми вкладышами
Период адаптации составил 18–21 сут. В условиях гидропонной установки высота побегов увеличивалась на 36,0–48,3 %. Способ фиксации оказывал влияние как на ростовые характеристики хмеля, так и на выживаемость. Регенеранты, адаптируемые в кюветах, показали худший результат по развитию побегов и корневой системы (рис. 3). Так, в кюветах прирост побегов составил в среднем 8,9 см, а в рассадных кассетах – на 19,3 % больше (11,1 см). Корневая система у всех адаптируемых в кассетах образцов была лучше развита и характеризовалась большим количеством корней 2-го порядка, величина самого длинного корня составляла 4 см и более (рис. 3, А). При использовании рассадных кассет не было потери растительного материала – выживало 100 % растений-регенерантов, при использовании кювет без субстрата процент адаптированных растений был ниже – 75 %, наиболее слабые растения погибали.
Рис. 3. Развитие регенерантов хмеля сорта Флагман на гидропонной установке:
А – в рассадных кассетах; Б – в кюветах с вкладышами
После 3 недель адаптации независимо от типа фиксации регенерантов на гидропонике средняя высота побегов была максимальной у сорта Таурус – 28,3 и 24,3 см, минимальной – 22,6 и 21,7 см у сорта Флагман. В то же время последний сорт при адаптации в кассетах обладал высокой кустистостью, формируя до 15 побегов 2-го порядка, средняя высота которых составляла 12,4 см (рис. 3, А).
Согласно литературным данным, высокий уровень приживаемости растений (90–100 %) на этапе адаптации ex vitro обеспечивает высаживание в субстраты растений с развитыми in vitro корнями [9]. Однако некоторые авторы предлагают укоренять и адаптировать микрорастения одновременно [10]. Для трудноукореняющихся растений это единственный способ адаптации растений к условиям ex vitro.
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о нецелесообразности адаптации регенерантов хмеля со слаборазвитой корневой системой. Доля жизнеспособных регенерантов после акклиматизации на гидропонике не превышала 15 % независимо от способа фиксации (рассадная кассета или кювета с вкладышами).
После адаптации на гидропонной установке растения пересаживались в рассадные горшки в подготовленные смеси. При этом не было необходимости накрывать только что высаженные растения пленкой для поддержания высокой влажности, было достаточно опрыскивания водой из распылителя однократно в течение трех суток. Состав большинства субстратов способствовал росту и развитию растений, 8 из 10 типов смесей показал 100 % приживаемость. В варианте торф : перегной в соотношении 3 : 1 не удалось адаптировать ни одного растения; в смеси чернозем : перегной (3 : 1) доля погибших образцов составила 20 %.
Средняя высота побегов в зависимости от
состава субстрата варьировала от 33,7 (чернозем : перегной, 3 : 1) до 63,7 см (чернозем : песок, 3 : 1). Количество побегов у одного растения составляло в среднем от 3,3 (чернозем : перегной, 3 : 1) до 8,0 шт. (чернозем). Развитие корневой системы происходило на всех субстратах. Достаточно плотный корневой ком сформировали растения в следующих субстратах: чернозем : торф (рис. 4, А); чернозем : перлит (3 : 1); чернозем : песок (3 : 1); торф : перлит (3 : 1); чернозем : торф II : перлит (1 : 1 : 1).
Для дальнейшего использования адаптированных регенерантов как посадочного материала лимитирующим фактором является развитие корневой системы, чем развитие надземной части. В природных условиях хмель как многолетняя травянистая лиана умеренного климата вегетирует только в теплый сезон и к зиме формирует мощные зимующие почки в прикорневой зоне. В течение всего периода живой остается только подземная часть, состоящая из главных корневищ и боковых корней [11].
Рис. 4. Хмель после двухэтапной адаптации:
А – корневая система саженцев, сформированная на торфе I; Б – корневая система саженцев, сформированная на смеси чернозема, торфа II, перлита; В – общий вид адаптированного растения
После адаптации с целью получения крепкого посадочного куста рекомендуется присыпать корневую шейку на 1–3 см, благодаря чему
происходит утолщение побега и закладка новых почек. Стебли, сформированные in vitro, следует срезать до высоты 2–3 междоузлий, благодаря чему развиваются новые побеги, регенерирующие из почек de novo, более крепкие, с крупными листьями (рис. 4, В).
Заключение. В ходе отработки схемы двухэтапной адаптации растений хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки показана нецелесообразность адаптации регенерантов со слаборазвитой корневой системой – их выживаемость на гидропонике не превышала 15 %. Определена длительность этапа адаптации на гидропонной системе, которая характеризуется устойчивым поддержанием тургора листьями и активным ростом побегов – 18–21 день. Показано, что в условиях гидропонной установки высота побегов увеличивалась на 36,0–48,3 %. Изучено влияние способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе: использование рассадных кассет с субстратом из перлита и вермикулита (1 : 1) показало на 25 % выше выживаемость растений по сравнению с бессубстратными кюветами с вкладышами из полиэтиленовой пленки. Последующий этап адаптации в большинстве торфосодержащих субстратов обеспечивает 100 % выживаемость и получение посадочного материала высокого качества.
