Введение. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является онкогенным В-лимфоцитотропным ретровирусом, который можно идентифицировать у 70 % инфицированных этим патогеном только по наличию антител и/или провирусной ДНК, а также по некоторой степени иммунной дисрегуляции, приводящей к значительным экономическим потерям в животноводстве вследствие снижения надоев молока, высокой частоты инфекционных заболеваний и репродуктивной неэффективности [1–3]. Помимо этого, ВЛКРС генетически родственен вирусу Т-клеточного лейкоза человека 1-го типа (HTLV-1), вызывающему у людей злокачественные новообразования лимфоидной и кроветворной тканей, что позволяет рассматривать его как модель для разработки профилактических и терапевтических стратегий против ретровирусных инфекций человека [4, 5].
Несмотря на широкое распространение лейкозной инфекции во многих странах мира и значительный экономический ущерб, наносимый этой болезнью, способов терапевтической элиминации вируса до сих пор не разработано. Осложняет применение лечения, а также традиционных стратегий вакцинации такая особенность цикла репликации ретровируса, как интеграция провируса в клеточный геном, обеспечивающая длительную экспрессию вирусных генов в инфицированных клетках и их потомках [6]. Поэтому для борьбы с этой инфекцией необходима разработка новых различных мер противодействия.
В настоящее время ведется активный поиск химических соединений из природных источников, обладающих противовирусной активностью в отношении ВЛКРС. В одном из таких исследований было показано, что violaceoid E (vioE), обнаруженный в грибах Aspergillus violaceofuscus, препятствует репликации и ингибирует транскрипцию вируса бычьего лейкоза, зависимую от белка Tax посредством прямого взаимодействия [7]. Для борьбы с лейкозной инфекцией могут быть также полезны компоненты, извлеченные из гриба Talaromyces sp., продуцирующего Vanitaracin A и другие вещества [8, 9]. Все это свидетельствует о том, что отдельные метаболические продукты могут служить эффективной структурой для конструирования новых противолейкозных средств.
Привлекательным в этом плане объектом также может служить получаемая из бетулина бетулиновая кислота, которая, как и ее предшественник, присутствует в основном в коре березы, но в меньших количествах – от 0,002 до 2 % в зависимости от метода экстракции [10]. Интерес к данному природному метаболиту вызван его мощными разнообразными биологическими и фармакологическими эффектами, из которых можно выделить противовирусную, противоопухолевую, противовоспалительную и иммуномодулирующую активность [11, 12], а также возможностью усиления выявленных свойств как в комбинации с другими средствами, так и посредством введения в их молекулы фармакофорных группировок [13–15].
В некоторых исследованиях было показано усиление противовирусной активности бетулиновой кислоты при лечении вирусного гепатита С в комбинации с α-интерфероном, телапревиром или софосбувиром [16], а также в отношении вируса гриппа при сочетании производных бетулина с римантадином [17]. Все это указывает на огромный научный интерес к осуществлению целенаправленной химической модификации бетулиновой кислоты.
В недавней нашей работе было продемонстрировано выраженное ингибирующее действие на ВЛКРС при сочетании в одной молекуле бетулиновой кислоты и 1-(адамантан-1-ил)этан1-амина, при этом выбор в качестве фармакофора аминопроизводного адамантана (римантадина) был связан не только с его противовирусной активностью, но в большей степени с антитоксическим и иммуномодулирующим действием, в частности с индукцией выработки α- и γ-интерферонов и усилением функциональной активности T- и B-лимфоцитов [18]. Однако для оценки влияния экспериментального препарата на организм животных необходимо более детальное изучение иммунобиологических реакций.
Цель исследования – изучить эффективность иммунных реакций у морских свинок, инфицированных вирусом бычьего лейкоза, после введения амида бетулиновой кислоты.
Задачи: анализ количественного содержания иммунокомпетентных клеток и функционального состояния нейтрофилов у морских свинок, инфицированных ВЛКРС; оценка иммунологической перестройки на однократное, двукратное и трехкратное введение амида бетулиновой кислоты морским свинкам, инфицированным ВЛКРС; оценка влияния производного бетулиновой кислоты на гуморальный иммунный ответ.
Объекты и методы. Объектом исследования являлись 4–5-месячные морские свинки линии агути, массой 400–500 г, с которыми проводился эксперимент в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.
Бетулиновая кислота и ее амидное производное были получены на кафедре органической и экологической химии Тюменского государственного университета (проф., д-р хим. наук И.В. Кулаков) и предоставлены нам для изучения биологической активности. Общая методика синтеза исследуемого соединения представлена в работе К.А. Barmina et al. (2025) [18].
Для инфицирования животных использовали 1 мл взвеси лимфоцитов, выделенной из свежеполученной стабилизированной крови больной лейкозом коровы центрифугированием на градиенте плотности 17 %-го раствора рентгеноконтрастного вещества (титр вируса в прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) составил 1 : 2048), внутрибрюшинно.
С целью изучения эффективности иммунных реакций было отобрано 25 клинически здоровых морских свинок, не имеющих по результатам диагностического исследования в прямой РИФ ВЛКРС, для формирования 5 групп по 5 особей в каждой. Животных 1–4-й групп подвергали инфицированию вирусом бычьего лейкоза, а 5-й группы использовали в качестве негативного контроля. Введение химического соединения 1-й опытной группе производили однократно, подкожно в дозе 40 мкг/кг за 2 ч до инокуляции патогена; 2-й – двукратно, за 2 ч до и через 7 сут после инфицирования тем же способом; 3-й – трехкратно, за 2 ч до, а затем на 7-е и 14-е сут после заражения. 4-я опытная группа не была подвергнута обработке экспериментальным препаратом и служила в качестве позитивного контроля. Через 45 и 90 сут от начала эксперимента осуществляли отбор проб крови из ретроорбитального венозного сплетения для диагностических и иммунологических исследований.
Оценку количественного состава цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), Т-, В-лимфоцитов и постановку теста с нитросиним тетразолием в спонтанном (НСТСП) и стимулированном (НСТСТ) вариантах с подсчетом коэффициента стимуляции (КС НСТ) осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями по оценке иммунного статуса при лейкозе крупного рогатого скота [19], а активность внутриклеточных компонентов нейтрофилов (миелопероксидаза (МПО), катионные белки (КБ)) – согласно методам Грэхем-Кнолля с использованием бензидина [20] и М.Г. Шубича с бромфеноловым синим [21]. При анализе мазков подсчитывали процент положительно прореагировавших клеток и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).
Для постановки прямой РИФ готовили мазки из взвеси лимфоцитов, выделенных из крови морских свинок центрифугированием в градиенте плотности тразографа®, и окрашивали их сконструированными нами диагностическими флуоресцирующими иммуноглобулинами против ВЛКРС [22]. Непрямую РИФ проводили путем микротитрования сыворотки крови в 96-луночных планшетах (с разведения 1 : 2 до 1 : 4096) с использованием компонентов из набора для диагностики лейкоза в реакции иммунодиффузии (антиген ВЛКРС, положительная сыворотка крови крупного рогатого скота в титре 1 : 2, отрицательная сыворотка крови крупного рогатого скота, ФКП «Курская биофабрика» – «Биок», Россия) и люминесцирующую сыворотку кролика против глобулинов морской свинки (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). За титр антител принимали предельное разведение сыворотки крови, при котором обнаружены антитела. Учет реакций осуществляли по 4-крестовой системе на микроскопе Axsiostar plus (Carl Zeiss, Германия). За положительный результат принимали специфическое свечение комплекса антигена – антитела с оценкой в 3–4 креста.
Расчет средней геометрической величины титра антител проводили в соответствии с МУ 3.1.2943-11 [23].
Для статистической обработки цифрового материала применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с оценкой значимости различий между группами с помощью F-критерия, а также последующим post-hoc анализом по критерию Тьюки для проведения множественных сравнений. Различия считали достоверными при p < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Оценка статистически значимых различий средних значений иммунологических параметров у морских свинок 5-й группы с помощью однофакторного дисперсионного анализа на 45-е сут после введения экспериментального препарата показала наличие неоднородности всех анализируемых показателей: лейкоцитов (F = 11,36; р < 0,001), лимфоцитов (F = 13,91; р < 0,001), Т-лимфоцитов (F = 3,34; р < 0,05), В-лимфоцитов (F = 61,75; р < 0,001), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 26,66; р < 0,001), спонтанного НСТ-теста (F = 13,58; р < 0,001), стимулированного НСТ-теста (F = 4,06; р < 0,05), коэффициента стимуляции НСТ (F = 7,92; р < 0,001), СЦК катионных белков (F = 27,19; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 5,31; р < 0,001).
Концентрация лейкоцитов была в 1,44 раза (р1 < 0,01) выше у морских свинок, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), относительно этого показателя в контрольной группе, тогда как у животных, подвергнутых трехкратной обработке производным бетулиновой кислоты, уровень клеток белой крови был ниже соответственно в 1,50 раза (р2 < 0,01) по сравнению с особями, которым был введен экспериментальный препарат однократно; в 1,46 раза (р3 < 0,01) против соответствующего параметра у морских свинок после двукратного его введения и в 1,68 раза (р4 < 0,001) относительно значений у животных 4-й группы (табл. 1).
Таблица 1
Иммунологические параметры у морских свинок
через 45 сут после инфицирования ВЛКРС, M ± m
Immunological parameters in guinea pigs 45 days after infection with BLV, M ± m
|
Показатель |
Контроль |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Лейкоциты, 109/л |
8,87±0,05 |
11,38±0,71 |
11,04±0,71 |
7,58±0,212,3 |
12,76±0,841,4 |
|
Лимфоциты, 109/л |
5,72±0,34 |
6,37±0,48 |
4,71±0,452 |
4,42±0,222 |
7,94±0,361,3,4 |
|
Т-лимфоциты, 109/л |
1,02±0,04 |
0,79±0,14 |
0,85±0,13 |
0,89±0,06 |
0,52±0,051 |
|
В-лимфоциты, 109/л |
0,47±0,07 |
0,47±0,09 |
0,73±0,09 |
0,33±0,043 |
2,01±0,131,2,3,4 |
|
ЦТЛ, 109/л |
0,74±0,12 |
0,61±0,10 |
0,77±0,08 |
0,30±0,004 |
2,12±0,251,2,3,4 |
|
НСТСП., ед. оп. пл. |
0,15±0,004 |
0,15±0,007 |
0,15±0,008 |
0,15±0,009 |
0,25±0,021,2,3,4 |
|
НСТСТ, ед. оп. пл. |
0,18±0,01 |
0,20±0,02 |
0,15±0,009 |
0,14±0,0062 |
0,20±0,03 |
|
КС НСТ |
1,19±0,13 |
1,38±0,12 |
1,01±0,042 |
0,95±0,022 |
0,82±0,031,2 |
|
СЦК МПО, у.е. |
1,07±0,09 |
1,70±0,151 |
1,52±0,101 |
1,29±0,07 |
1,45±0,02 |
|
СЦК КБ, у.е. |
1,06±0,03 |
1,47±0,061 |
1,29±0,031 |
1,26±0,021,2 |
1,71±0,061,2,3,4 |
Здесь и далее: статистически значимое различие (р1234 < 0,05 и ниже) по критерию Тьюки: 1 – относительно контрольной группы; 2 – относительно 1-й опытной группы; 3 – относительно 2-й опытной группы; 4 – относительно 3-й опытной группы.
Содержание лимфоцитов у особей, инфицированных ВЛКРС, показало выраженные изменения относительно контрольной, а также 2-й и 3-й опытных групп, в которых наблюдали снижение уровня этого параметра соответственно в 1,39 (р1 < 0,01), в 1,68 (р3 < 0,001) и в 1,8 раза (р4 < 0,001). Помимо этого, по сравнению с морскими свинками, подвергнутыми однократному введению производного бетулиновой кислоты, у животных 2-й и 3-й опытных групп, где была предусмотрена неоднократная инокуляция препарата, также происходило снижение концентрации лимфоцитов соответственно в 1,35 (р2 < 0,05) и в 1,44 раза (р2 < 0,05).
У морских свинок, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), число лимфоидных клеток увеличивалось за счет пролиферации В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. В частности их концентрация по сравнению с контрольной группой возрастала соответственно в 4,28 и 2,86 раза (р1 < 0,001), с 1-й группой – в 4,28 и 3,47 раза (р2 < 0,001), со 2-й группой – в 2,75 раза (р3 < 0,001) и по сравнению с 3-й группой – в 6,09 и 7,06 раза (р4 < 0,001). Следует также отметить снижение в 2,1 раза (р3 < 0,05) числа В-лимфоцитов у особей, подвергнутых трехкратной обработке препаратом, относительно этого параметра у животных, которым был введен иммуномодулятор двукратно.
В отличие от других иммунокомпетентных клеток число Т-лимфоцитов подвергалось снижению, но статистически достоверной разницы оно достигало только в группе инфицированных без предварительной обработки препаратом (4-я группа), где относительно контроля их концентрация уменьшалась в 1,96 раза (р1 ˂ 0,05).
Наиболее выраженные изменения иммунной функции нейтрофилов также были зарегистрированы в 4-й опытной группе, в которой наблюдали увеличение спонтанной НСТ активности. Так, относительно значений этого показателя у интактных животных, а также 1–3-х опытных групп, наблюдали усиление тетразолиевой деятельности в 1,67 раза (р1234 ˂ 0,001). Следует отметить, что в случае стимуляции клеточной взвеси антигеном интенсивность внутриклеточного метаболизма не претерпевала существенных изменений, за исключением морских свинок, подвергнутых трехкратной обработке производным бетулиновой кислоты (3-я группа), где уровень генерации активных форм кислорода относительно 1-й опытной группы был ниже в 1,43 раза (р2 ˂ 0,05).
Коэффициент стимуляции НСТ, характеризующий готовность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу, относительно контрольной группы имел статистически значимое различие только с группой инфицированных ВЛКРС без введения препарата (4-я группа), в которой этот показатель снижался в 1,45 раза (р1 ˂ 0,05). Помимо этого, относительно значений морских свинок, подвергнутых однократной обработке производным бетулиновой кислоты (1-я группа), зарегистрировано снижение КС НСТ во 2-й группе в 1,37 раза (р2 ˂ 0,05), в 3-й группе – в 1,45 раза (р2 ˂ 0,01) и в 4-й группе в – 1,68 раза (р2 ˂ 0,001).
Ферментная активность миелопероксидазы нейтрофилов, так же, как и НСТ-тест, характеризующая кислород-продуцирующую деятельность бактерицидных систем, имела тенденцию к усилению, особенно это касалось 1-й и 2-й опытных групп, в которых после введения препарата наблюдали возрастание СЦК МПО относительно контроля соответственно в 1,59 (р1 ˂ 0,01) и в 1,42 раза (р1 ˂ 0,05).
Более выраженная трансформация была выявлена при анализе содержания катионных белков нейтрофилов – показателя, ответственного за кислород-независимый внутриклеточный метаболизм. В частности СЦК КБ достигал самых высоких значений у животных, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), и был выше в 1,61 раза (р1 ˂ 0,001) по сравнению с интактными особями, а также в 1,16–1,32 раза (р2 ˂ 0,01; р34 ˂ 0,001) относительно 1–3-х групп, в которых была предусмотрена обработка морских свинок препаратом.
Необходимо также отметить, что уровень СЦК КБ в 1–3-х группах относительно контрольной группы также имел значимый рост соответственно в 1,39 (р1 ˂ 0,001), в 1,21 (р1 ˂ 0,05) и 1,19 (р1 ˂ 0,05) раза. Помимо этого, у особей, подвергнутых трехкратному введению экспериментального соединения (3-я группа), активность антимикробных пептидов была в 1,17 раза ниже (р2 ˂ 0,05), чем в группе животных, обработанных однократно (1-я группа).
В соответствии с результатами однофакторного дисперсионного анализа иммунологических параметров морских свинок на 90-е сут эксперимента выявлены статистически значимые различия между группами по содержанию лейкоцитов (F = 6,2; р < 0,01), лимфоцитов (F = 12,99; р < 0,001), В-лимфоцитов (F = 61,6; р < 0,001), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 18,8; р < 0,001), а также по показателям, характеризующим функциональное состояние нейтрофилов, в частности спонтанного НСТ-теста (F = 7,43; р < 0,001), стимулированного НСТ-теста (F = 2,95; р < 0,05), коэффициента стимуляции НСТ (F = 10,8; р < 0,001), СЦК катионных белков (F = 18,6; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 18,2; р < 0,001).
Анализ иммунологических параметров, представленный в таблице 2, показал, что на 90-е сут после инокуляции патогена наблюдалось значимое повышение численности клеток белой крови только в группе особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), относительно показателей у интактных животных в 1,25 раза (р1 < 0,05), а также по сравнению с 1-й группой в 1,21 раза (р2 < 0,05) и с 3-й группой в 1,35 раза (р4 < 0,01), в которых была произведена обработка морских свинок амидом бетулиновой кислоты соответственно 1 и 3 раза.
Идентичная тенденция изменений была также характерна для числа лимфоцитов. Так, в 4-й группе морских свинок относительно контроля наблюдалось повышение их количества в 1,53 раза (р1 < 0,001), 1-й группы – в 1,66 раза (р2 < 0,001), 2-й – в 1,32 (р3 < 0,05) и 3-й групппы – в 1,66 раза (р4 < 0,001). Необходимо также отметить, что концентрация лейкоцитов и лимфоцитов у особей, подвергнутых трехкратному введению препарата, в отличие от животных остальных групп имела некоторую тенденцию к снижению по сравнению с контрольными значениями.
Таблица 2
Иммунологические параметры у морских свинок через 90 сут
после инфицирования ВЛКРС, M ± m
Immunological parameters in guinea pigs 90 days after infection with BLV, M ± m
|
Показатель |
Контроль |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Лейкоциты, 109/л |
11,60±0,28 |
12,00±0,56 |
12,62±0,36 |
10,76±0,84 |
14,58±0,60124 |
|
Лимфоциты, 109/л |
6,07±0,31 |
5,59±0,31 |
7,04±0,47 |
5,60±0,63 |
9,29±0,311234 |
|
Т-лимфоциты, 109/л |
0,99±0,05 |
1,09±0,13 |
0,83±0,09 |
1,44±0,35 |
0,81±0,17 |
|
В-лимфоциты, 109/л |
0,76±0,14 |
0,69±0,12 |
1,50±0,052 |
0,90±0,22 |
4,16±0,291234 |
|
ЦТЛ, 109/л |
1,14±0,06 |
0,55±0,02 |
0,71±0,08 |
0,81±0,16 |
2,32±0,301234 |
|
НСТСП., ед. оп. пл. |
0,18±0,005 |
0,21±0,02 |
0,14±0,0072 |
0,18±0,01 |
0,22±0,013 |
|
НСТСТ, ед. оп. пл. |
0,17±0,006 |
0,22±0,02 |
0,16±0,0092 |
0,18±0,007 |
0,20±0,01 |
|
КС НСТ |
0,99±0,04 |
1,04±0,02 |
1,13±0,021 |
0,99±0,023 |
0,91±0,0223 |
|
СЦК МПО, у.е. |
1,17±0,05 |
1,58±0,101 |
1,38±0,08 |
1,94±0,06123 |
1,20±0,0524 |
|
СЦК КБ, у.е. |
1,16±0,08 |
1,59±0,071 |
1,56±0,091 |
1,95±0,0613 |
1,10±0,07234 |
Статистически значимых изменений на 90-е сут, в отличие от предыдущего срока исследования, в содержании Т-лимфоцитов нами не было выявлено, что было связано с усилением пролиферации лейкоцитов и лимфоцитов. Тем не менее следует выделить недостоверное увеличение количества Т-клеток при трехкратном введении экспериментального препарата (3-я группа), несмотря на то, что, как было отмечено ранее, только в этой группе прослеживалось снижение концентрации лейкоцитов и лимфоцитов по сравнению с интактными особями.
Как и в предыдущий срок исследования, происходило выраженное увеличение концентрации В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Так, относительно контрольных значений их количество возросло соответственно в 5,47 (р1 < 0,001) и 2,03 раза (р1 < 0,01), 1-й групппы – в 6,03 и 4,22 раза (р2 < 0,001), 2-й – в 2,77 и 3,27 раза (р3 < 0,001) и 3-й группы – в 4,62 и 2,86 раза (р4 < 0,001). Помимо этого, выявлена достоверная разница в содержании В-лимфоцитов между 1-й и 2-й опытными группами, где у последних наблюдали повышение числа этих клеток в 2,17 раза (р2 < 0,05).
Уровень спонтанной генерации активных форм кислорода приобретал максимальные значения у морских свинок, инфицированных вирусом лейкоза, и был выше в 1,57 раза относительно показателей 2-й группы (р3 < 0,01).
Животные, подвергнутые двукратному введению препарата (2-я группа), также имели более низкую тетразолиевую активность как при постановке спонтанного, так и стимулированного НСТ-теста относительно 1-й опытной группы, в которой эти параметры были выше соответственно в 1,5 (р2 < 0,01) и 1,37 раза (р2 < 0,05).
Наиболее высокие значения коэффициент стимуляции НСТ приобретал у особей, обработанных производным бетулиновой кислоты двукратно (2-я группа), и был выше в 1,14 раза по сравнению с контрольной и 3-й опытными группами (р13 < 0,01), а также в 1,24 раза по сравнению с 4-й группой (р3 < 0,001). Помимо этого, у морских свинок, инфицированных ВЛКРС, этот показатель снижался в 1,14 раза относительно 1-й группы (р2 < 0,05).
В отличие от предыдущего срока исследования уровень СЦК МПО, и особенно СЦК КБ, у особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), подвергался существенному снижению до уровня контрольной группы, что связано с угнетением деятельности внутриклеточных бактерицидных компонентов нейтрофилов. В то же время независимо от кратности введения экспериментального препарата происходило усиление функциональной активности лейкоцитов. Так, эти два параметра относительно контроля в 1-й группе увеличивались соответственно в 1,35 (р1 < 0,01) и 1,37 раза (р1 < 0,05), во 2-й – в 1,18 и 1,34 раза (р1 < 0,05) и в 3-й – в 1,66 (р1 < 0,001) и 1,68 раза (р1 < 0,001).
Необходимо отметить, что максимальной активности бактерицидные компоненты нейтрофилов достигали в случае трехкратного введения производного бетулиновой кислоты (3-я группа), в значительной мере превышая значения, установленные в других группах. В частности по сравнению с животными 1-й группы СЦК МПО был выше в 1,23 раза (р2 < 0,05), а относительно 2-й группы – в 1,4 раза (р3 < 0,001). Аналогичная траектория изменений была также характерна и для СЦК КБ, но достоверная разница в 1,25 раза была выявлена только относительно 2-й группы (р3 < 0,05).
У морских свинок, инфицированных ВЛКРС, ферментная активность миелопероксидазы была снижена в 1,32 раза относительно 1-й группы (р2 < 0,05) и в 1,62 раза по сравнению с 3-й группой (р4 < 0,001). В свою очередь содержание катионных белков нейтрофилов уменьшалось относительно соответствующего показателя в 1–3-х группах соответственно в 1,44 (р2 < 0,01), в 1,42 (р3 < 0,05) и в 1,77 раза (р4 < 0,001).
По результатам диагностических исследований в прямой РИФ к 90-м сут от начала эксперимента у 100 % особей 4-й опытной группы, у 80 % – 1-й группы и у 20 % животных 2-й и 3-й групп был выявлен ВЛКРС. У морских свинок контрольной группы реакция была отрицательной.
Следует отметить, что в непрямой РИФ у инфицированных морских свинок, которым не был введен препарат, титр антител варьировал от 1 : 128 до 1 : 2048, тогда как при двукратном и трехкратном введении производного бетулиновой кислоты эти значения были ниже. Так, во 2-й опытной группе при обнаружении антигена в прямой РИФ титр антител составил 1 : 128, а при его отсутствии – от 1 : 8 до 1 : 64, а в 3-й опытной группе – 1 : 64 и 1 : 8 соответственно.
В таблице 3 представлены среднегеометрические титры антител у животных 1–4-х групп.
Таблица 3
Влияние амида бетулиновой кислоты на титр антител
в реакции непрямой иммунофлюоресценции, M ± m
Effect of betulinic acid amide on the antibody titer in the indirect immunofluorescence reaction, M ± m
|
Срок исследования, сут |
Титры антител в непрямой РИФ, log2 |
|||
|
1-я опытная группа |
2-я опытная группа |
3-я опытная группа |
4-я опытная группа |
|
|
45 |
7,60±0,93 |
7,20±0,97 |
4,40±0,68 |
9,00±0,712 |
|
90 |
7,00±0,77 |
5,80±0,37 |
4,20±0,731 |
7,80±0,372 |
Примечание: статистически значимое различие (р12 < 0,05 и ниже) по критерию Тьюки: 1 – относительно 1-й опытной группы; 2 – относительно 3-й опытной группы.
Однофакторный дисперсионный анализ среднегеометрических титров антител выявил статистически значимые различия между группами по их содержанию как на 45-е сут (F = 5,38; р < 0,01), так и на 90-е сут эксперимента (F = 6,91; р < 0,01).
Наблюдалось значимое снижение титров антител в 3-й опытной группе относительно особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), в 2 раза (р1 < 0,01) на 45-е сут и в 1,86 раза (р1 < 0,01) на 90-е сут после инокуляции патогена. Помимо этого статистически достоверная разница среднегеометрических титров антител отмечена между 3-й и 1-й опытными группами, где у животных, подвергнутых однократной обработке препаратом, выявлено их увеличение в 1,67 раза (р2 < 0,05).
Таким образом, инфицирование морских свинок вирусом бычьего лейкоза сопровождалось выраженными изменениями подавляющего большинства анализируемых параметров иммунного статуса. Выявленные отклонения патогномоничны для лейкозной инфекции крупного рогатого скота, в частности ранее в других работах также были описаны пролиферация клеток, несущих рецепторы к С3 компоненту комплемента у коров, инфицированных ВЛКРС [24], цитотоксических Т-лимфоцитов – при экспериментальном заражении овец [25], а также дефекты аэробных и анаэробных бактерицидных систем нейтрофилов [26, 27]. Введение морским свинкам амида бетулиновой кислоты перед инокуляцией патогена способствовало ингибированию клеточного размножения В-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также усиливало деятельность бактерицидных систем нейтрофилов, что связано с иммунологической перестройкой, направленной на снижение вирусной нагрузки, индуцированной действием препарата. Эффективность иммунных реакций повышалась при трехкратной обработке химическим соединением, о чем также свидетельствовало наиболее выраженное снижение титров антител в непрямой РИФ.
Заключение. На основании полученных результатов можно прийти к выводу, что при трехкратном введении с интервалом 7 сут амида бетулиновой кислоты в дозе 40 мкг/кг морским свинкам, инфицированным ВЛКРС, был наиболее выражен иммуномодулирующий эффект, который характеризовался нормализацией числа лейкоцитов, лимфоидных клеток за счет подавления размножения В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов, восстановлением параметров тетразолиевой активности нейтрофилов, а также увеличением количества Т-лимфоцитов в 1,45 раза и нарастанием интенсивности деятельности внутриклеточных компонентов фагоцитов миелопероксидазы и катионных белков в 1,66 и 1,68 раза.
Диагностическое исследование иммунофлюоресцентным методом также указывало на более высокую эффективность трехкратного введения экспериментального препарата, о чем свидетельствовало отсутствие ВЛКРС у 80 % морских свинок, а также снижение среднегеометрического титра антител в 1,86 раза.
