Россия
Россия
ВАК 1.5.11 Микробиология
ВАК 4.1.2 Селекция, семеноводство и биотехнология растений
ВАК 4.1.3 Агрохимия, агропочвоведение
ВАК 4.1.4 Садоводство, овощеводство, виноградарство и лекарственные культуры
ВАК 4.1.5 Мелиорация, водное хозяйство и агрофизика
ВАК 4.2.1 Патология животных, морфология, физиология, фармакология и токсикология
ВАК 4.2.2 Санитария, гигиена, экология, ветеринарно-санитарная экспертиза и биобезопасность
ВАК 4.2.3 Инфекционные болезни и иммунология животных
ВАК 4.2.4 Частная зоотехния, кормление, технологии приготовления кормов и производства продукции животноводства
ВАК 4.2.5 Разведение, селекция, генетика и биотехнология животных
ВАК 4.3.3 Пищевые системы
ВАК 4.3.5 Биотехнология продуктов питания и биологически активных веществ
УДК 579.64 Сельскохозяйственная микробиология
Цель исследования – оценить антибиотическую активность различных представителей семейства Bacillaceae в отношении возбудителей плесневения семян рапса Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp. В качестве представителей семейства Bacillaceae использованы 23 штамма Bacillus altitudinis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Peribacillus simplex, Bacillus sp., которые были выделены из сельскохозяйственных почв Красноярского края и в предыдущих исследованиях продемонстрировали антибиотическую активность в отношении возбудителей болезней рапса Fusarium spp., Alternaria spp. и Sclerotinia sclerotiorum. Антибиотическую активность штаммов-антагонистов в отношении возбудителей плесневения семян определяли методом встречных культур на чашках Петри, в качестве показателя антибиотической активности использовали зону подавления роста тест-культуры. Из 23 штаммов-антагонистов 20 проявили антибиотическую активность в отношении как минимум одной тест-культуры, 3 штамма не показали антагонизма в отношении ни одной из тест-культур. С помощью дисперсионного анализа выявлено, что антибиотическая активность статистически значимо (p < 0,001) зависит от факторов «штамм-антагонист», «тест-культура» и взаимодействия факторов «штамм-антагонист» «тест-культура» с показателями силы влияния 21,73 %, 17,99 и 42,32 % соответственно. В среднем по тест-культурам максимальный антибиотический эффект проявили штаммы RSA16(1) и RSA20(2), минимальный – штаммы Хч.1 и СХ5. Способность подавлять рост всех без исключения тест-культур продемонстрировали только штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis). С учетом средней по тест-культурам антибиотической активности для биологической борьбы с плесневением семян можно рекомендовать использование штаммов RSA16(1) или RSA20(2).
Brassica napus L., плесневение семян, Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., биологическая защита, семейство Bacillaceae
Введение. Рапс (Brassica napus L.) широко используется в качестве пищевой, кормовой и технической культуры. При переработке семян рапса получают рапсовое масло, используемое как в кулинарии, так и в качестве биодизеля, а также высокобелковый жмых, используемый в качестве корма в животноводстве [1]. За последнее десятилетие мировое производство рапса выросло более чем на 20 %, сделав рапс второй по значимости масляничной культурой, на долю которой приходится более 12 % мирового производства растительного масла [2]. В Российской Федерации темпы роста производства рапса значительно превышают общемировые, а лидером среди субъектов федерации по посевным площадям под данной культурой является Красноярский край [3].
Одним из главных факторов, препятствующих полной реализации биологического потенциала рапса в плане урожайности, являются передающиеся через семена фитопатогенные грибы (главным образом представители родов Fusarium и Alternaria), а также возбудители плесневения семян р.р. Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Mucor. При этом возбудители плесневения семян, хотя формально и не являются фитопатогенами, поражают семена при хранении, значительно снижая их посевные качества, что позволяет отнести данные грибы к возбудителям болезней растений [4, 5].
Наиболее распространенным способом борьбы с возбудителями болезней рапса и других культур является предпосевное протравливание семян фунгицидами. Однако данный метод экологически небезопасен и ведет к повышению химической нагрузки на окружающую среду. Кроме того, во всем мире наблюдается неуклонный рост резистентности фитопатогенных микроорганизмов к применяемым химическим препаратам [6, 7]. Перспективной альтернативой химическим протравителям являются биопрепараты на основе штаммов-антагонистов возбудителей болезней [8]. При этом, по мнению ряда авторов, предпочтение следует отдавать биопрепаратам, созданным на основе комбинации штаммов-антагонистов [9, 10]. Ранее нами была продемонстрирована возможность использования выделенных из автохтонных почвенных и ризосферных микробных сообществ штаммов сем. Bacillaceae в качестве антагонистов актуальных для Красноярского края возбудителей грибных болезней рапса Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum и предложены комбинации этих штаммов для создания биопрепаратов широкого спектра действия [11].
Цель исследования – оценить антибиотическую активность различных представителей семейства Bacillaceae в отношении возбудителей плесневения семян рапса Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp.
Объекты и методы. В качестве антагонистов использовали выделенные нами из почвенных и ризосферных сообществ Красноярского края штаммы Bacillus altitudinis RSA2, Bacillus atrophaeus RSA9, RSA19, СХ6, RSA1 (запатентован авторами под номером B-13893), RSA8, RSA16(1), RSA16(2), RSA18, Bacillus cereus АЛ3, СХ5, Bacillus megaterium RSA4, Bacillus simplex RSA15, Bacillus subtilis RSA17, RSA20(1), RSA20(2), RSA11, Bacillus sp. Ра1, Ра2, Ра3, Ал4, Хч.1 и Peribacillus simplex RSA12. Выбор данных штаммов обусловлен тем, что в предыдущих исследованиях они показали высокую антибиотическую активность против фитопатогенных грибов – возбудителей болезней ярового рапса Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria spp. и Fusarium spp. [11, 12].
В качестве тест-культур использовали изоляты Fusarium sp., Aspergillus sp., Mucor sp. и два различающихся на уровне принадлежности к разным видам изолята Penicillium sp. Указанные изоляты были выделены нами из пораженных плесневыми грибами семян рапса сорта Надежный 92 производства федерального государственного унитарного предприятия «Михайловское» (Красноярский край, Ужурский район), урожай 2023 г. Проверку антибиотической активности изучаемых штаммов в отношении возбудителей плесневения семян выполняли методом двойных (встречных) культур (dual culture assay) по ширине зоны отсутствия роста тест-культуры в присутствии штамма-антагониста [12, 13] (рис. 1). В качестве питательной среды, хорошо поддерживающей рост как изучаемых штаммов, так и мицелиальных грибов, использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в два раза и дополненную агаром до 20 г/л [12, 14]; время инкубирования составляло 10 сут, температура инкубирования (25 ± 1) °C; повторность трехкратная.
Статистическую обработку результатов проводили двухфакторным дисперсионным анализом, факторами служили тест-культура гриба и штамм бактерий-антагонистов. В качестве post hoc тестов для парного сравнения индивидуальных средних после проведения дисперсионного анализа использовали тесты Шеффе и Тьюки [15]; в качестве программного обеспечения использовали математический пакет StatSoft STATISTICA 8.0.
Рис. 1. Метод встречных культур на примере изолята Mucor sp.:
1 – рост гриба в контроле; 2 – в присутствии штамма-антагониста RSA16(2)
Counterculture method using the Mucor sp. isolate as an example:
1 – fungal growth in the control; 2 – in the presence of the antagonist strain RSA16(2)
Результаты и их обсуждение. Из 23 протестированных штаммов 3 не проявили антибиотической активности в отношении тест-культур, остальные 20 ингибировали рост как минимум одной тест-культуры; при этом уровень антибиотической активности зависел как от тест-культуры, так и от штамма (табл. 1, рис. 2, 3).
Таблица 1
Зоны подавления роста тест-культур в присутствии изучаемых штаммов
(представлены данные, усредненные по трем повторностям),мм
Zones of growth inhibition of test cultures within the studied strains
(data are presented, averaged over three repetitions), mm
|
Штамм |
Тест-культура |
||||
|
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium |
Mucor sp. |
||
|
изолят 1 |
изолят 2 |
||||
|
RSA1 |
7,00 |
7,00 |
11,33 |
0,00 |
10,33 |
|
RSA2 |
10,00 |
0,00 |
9,81 |
21,00 |
0,00 |
|
RSA8 |
1,33 |
10,00 |
14,00 |
0,00 |
10,33 |
|
RSA9 |
10,67 |
4,67 |
7,00 |
0,00 |
9,00 |
|
RSA11 |
9,67 |
12,00 |
12,00 |
0,00 |
15,33 |
|
RSA15 |
0,00 |
5,33 |
10,00 |
0,00 |
6,00 |
|
RSA16(1) |
15,00 |
12,00 |
9,33 |
11,00 |
13,00 |
|
RSA16(2) |
13,67 |
9,33 |
0,00 |
0,00 |
15,67 |
|
RSA17 |
13,00 |
12,00 |
13,00 |
0,00 |
15,00 |
|
RSA18 |
0,00 |
9,00 |
14,00 |
0,00 |
4,33 |
|
RSA19 |
12,33 |
8,33 |
10,00 |
0,00 |
11,33 |
|
RSA20(1) |
8,00 |
11,67 |
11,00 |
7,00 |
10,00 |
|
RSA20(2) |
11,67 |
10,00 |
17,33 |
3,67 |
13,33 |
|
Хч.1 |
3,00 |
0,00 |
4,67 |
0,00 |
0,00 |
|
CХ5 |
0,00 |
11,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
|
СХ6 |
13,33 |
0,00 |
10,33 |
3,67 |
11,33 |
|
АЛ3 |
13,67 |
4,00 |
12,00 |
0,00 |
10,67 |
|
АЛ4 |
12,67 |
11,00 |
12,33 |
0,00 |
8,33 |
|
Ра3 |
8,67 |
0,00 |
8,33 |
0,00 |
0,00 |
Статистическая значимость влияния факторов «тест-культура», «штамм бактерий», а также эффекта взаимодействия факторов «тест-культура» × «штамм бактерий» составила p < 0,001; соответствующие показатели силы влияния равны 17,99 %; 21,73; и 42,32 %; на долю случайного варьирования пришлось 17,95 %. Таким образом, основной вклад в варьирование зоны отсутствия роста внесли индивидуальные особенности воздействия штаммов на конкретные тест-культуры.
Рис. 2. Зависимость зоны подавления роста тест-культуры
(на примере изолята Aspergillus sp.) от штамма-антагониста:
1 – штамм RSA20(1), видна ярко выраженная зона отсутствия роста тест-культуры;
2 – штамм СХ5, зона отсутствия роста тест-культуры не выражена
Dependence of the test culture growth inhibition zone
(using an Aspergillus sp. isolate as an example) on the antagonist strain:
1 – strain RSA20(1), a clearly visible zone of test culture growth inhibition is visible;
2 – strain CX5, the zone of test culture growth inhibition is not clearly visible
Рис. 3. Зависимость антибиотической активности штаммов-антагонистов (на примерештамма RSA8) от тест-культуры:
1 – тест-культура Fusarium sp., зона отсутствия роста тест-культуры ярко выражена; 2 – тест-культура Aspergillus sp., зона отсутствия роста тест-культуры выражена слабо
Dependence of the antibiotic activity of antagonist strains
(using the RSA8 strain as an example) on the test culture:
1 – Fusarium sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is clearly expressed;
2 – Aspergillus sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is weakly expressed
В среднем по использованным в работе изолятам возбудителей плесневения семян максимальный антифунгальный эффект показали штаммы RSA16(1) и RSA20(2), минимальный – штаммы Хч.1 и СХ5 (рис. 4).
Рис. 4. Средняя по изолятам возбудителей плесневения семян зона отсутствия роста
тест-культур в присутствии штаммов-антагонистов, мм
Average zone of no growth of test cultures in the presence of antagonist strains for isolates
of seed mold pathogens, mm
При этом способность подавлять рост всех без исключения тест-культур продемонстрировали только штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis).
Среди тест-культур максимальную чувствительность к набору изученных штаммов проявил Penicillium sp. (изолят 1), минимальную – Penicillium sp. (изолят 2) (рис. 5).
Рис. 5. Средняя по штаммам-антагонистам зона отсутствия роста у разных тест-культур, мм
Average zone of no growth for antagonist strains in different test cultures, mm
Тесты Шеффе и Тьюки показали, что статистически значимые различия по средней чувствительности к штаммам-антагонистам наблюдаются между Penicillium sp. (изолят 2) и всеми остальными тест-культурами, а также между Penicillium sp. (изолят 1) и Fusarium sp. (табл. 4, 5).
Таблица 4
Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней
чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Шеффе (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой)
Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set
of studied strains using the Scheffe test (numbers in cells indicate the statistical significance
of differences (p) rounded to three decimal places)
|
Тест-культура |
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium sp. |
|
|
изолят 1 |
изолят 2 |
|||
|
Aspergillus sp. |
0,247 |
0,395 |
0,000 |
|
|
Fusarium sp. |
0,247 |
0,001 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 1) |
0,395 |
0,001 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 2) |
0,000 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Mucor sp. |
1,000 |
0,235 |
0,411 |
0,000 |
Таблица 5
Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней
чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Тьюки (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой)
Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set
of studied strains using the Tukey test (numbers in cells indicate the statistical significance
of differences (p) rounded to three decimal places)
|
Тест-культура |
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium sp. |
|
|
изолят 1 |
изолят 2 |
|||
|
Aspergillus sp. |
0,133 |
0,254 |
0,000 |
|
|
Fusarium sp. |
0,133 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 1) |
0,254 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 2) |
0,000 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Mucor sp. |
1,000 |
0,124 |
0,268 |
0,000 |
Полученные результаты можно интерпретировать следующим образом. Изученные штаммы-антагонисты выделяют не одно антибиотическое вещество, а набор подобных веществ. При этом конкретный состав набора зависит от штамма. В то же время чувствительность возбудителей плесневения семян к разным антибиотическим веществам из этого набора определяется видовой принадлежностью возбудителя. Данные результаты хорошо согласуются с результатами аналогичного исследования, проведенного нами на наборе фитопатогенных грибов – возбудителей болезней рапса [10].
Заключение. На основе изучения антибиотической активности 23 штаммов сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, в отношении 4 таксономически различающихся возбудителей плесневения семян рапса установлено, что лишь 3 штамма проявили способность подавлять рост всех без исключения тест-культур. Такую способность продемонстрировали штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis). С учетом средней по тест-культурам антибиотической активности для биологической борьбы с плесневением семян можно рекомендовать использование штаммов RSA16(1) или RSA20(2).
1. Raboanatahiry N., Li H., Yu L., et al. Rapeseed (Brassica napus): Processing, Utilization, and Genetic Improvement // Agronomy. 2021. Vol. 11. P. 1776. DOI:https://doi.org/10.3390/agronomy11091776.
2. Zheng Q., Liu K. Worldwide rapeseed (Brassica napus L.) research: A bibliometric analysis during 2011–2021 // Oil Crop Science. 2022. Vol. 7, is. 4. P. 157–165. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ocsci.2022.11.004.
3. Росстат – Федеральная служба государственной статистики. Бюллетень «Посевные площади Российской Федерации в 2024 году (весеннего учета)». Доступно по https://rosstat.gov.ru/compendium/document/13277. Ссылка активна на 17.07.2024.
4. Григорьев Е.В., Постовалов А.А. Реакция ярового рапса на обработку посевов жидкими минеральными удобрениями // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2018. № 1 (41). С. 60–63. DOI:https://doi.org/10.18286/1816-4501-2018-1-60-63.
5. Аболенцева П.А., Хижняк С.В., Халипский А.Н., и др. Таксономический состав и распространенность инфекции семян ярового рапса в Красноярском крае // Вестник КрасГАУ. 2023. № 12 (201). С. 111–120. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2023-12-111-120.
6. Hollomon D.W. Fungicide Resistance: 40 Years on and Still a Major Problem. In: Ishii H., Hollomon D., editors. Fungicide Resistance in Plant Pathogens. Springer, Tokyo. 2015. DOI:https://doi.org/10.1007/978-4-431-55642-8_1.
7. Thind T.S. New insights into fungicide resistance: a growing challenge in crop protection // Indian Phytopathology. 2022. Vol. 75, N 4. P. 927–939.
8. Butu M., Stef R., Grozea I., et al. Biopesticides: Clean and Viable Technology for Healthy Environment // Bioremediation and Biotechnology. 2020. P. 107–151. DOI:https://doi.org/10.1007/978-3-030-35691-0_6.
9. Niu B., Wang W., Yuan Z., et al. Microbial interactions within multiple-strain biological control agents impact soil-borne plant disease // Frontiers in Microbiology. 2020. Vol. 11. P. 585404.
10. Maciag T., Kozieł E., Rusin P., et al. Microbial Consortia for Plant Protection against Diseases: More than the Sum of Its Parts // International Journal of Molecular Sciences. 2023. Vol. 24, N 15. P. 12227.
11. Хижняк С.В., Аболенцева П.А., Овсянкина С.В., и др. Многомерные статистические методы как инструмент при выборе штаммов-антагонистов для биологической защиты растений от болезней // Вестник КрасГАУ. 2024. №. 4 (205). С. 36–45. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2024-4-36-45.
12. Аболенцева П.А., Хижняк С.В., Овсянкина С.В., и др. Эффективность представителей сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, против возбудителей грибных болезней картофеля // Вестник КрасГАУ. 2024. № 3 (204). С. 3–10. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2024-3-3-10.
13. Kim W.G., Weon H.Y., Seok S.J., et al. In vitro antagonistic characteristics of Bacilli isolates against Trichoderma spp. and three species of mushrooms // Mycobiology. 2008. Vol. 36, N 4. P. 266–269.
14. Родовиков С.А., Чураков А.А., Попова Н.М., и др. Почвенные микробные сообщества как источник штаммов для биологической защиты сои от фузариоза в Приенисейской Сибири // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2020. №. 2. С. 4–11.
15. Midway S., Robertson M.D., Flinn S., et al. Comparing multiple comparisons: practical guidance for choosing the best multiple comparisons test // PeerJ. 2020. Vol. 8. P. e10387. DOI:https://doi.org/10.7717/peerj.10387.
