Russian Federation
Russian Federation
VAK Russia 1.5.11
VAK Russia 4.1.2
VAK Russia 4.1.3
VAK Russia 4.1.4
VAK Russia 4.1.5
VAK Russia 4.2.1
VAK Russia 4.2.2
VAK Russia 4.2.3
VAK Russia 4.2.4
VAK Russia 4.2.5
VAK Russia 4.3.3
VAK Russia 4.3.5
UDC 579.64
The aim of the study is to evaluate the antibiotic activity of various representatives of the Bacillaceae family against the causative agents of rapeseed mold Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., and Mucor sp. Twenty-three strains of Bacillaceae family were used as representatives of the Bacillaceae family: Bacillus altitudinis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Peribacillus simplex, and Bacillus sp., which were isolated from agricultural soils of the Krasnoyarsk Region and had previously demonstrated antibiotic activity against the causative agents of rapeseed diseases Fusarium spp., Alternaria spp., and Sclerotinia sclerotiorum. The antibiotic activity of antagonist strains against the causative agents of seed mold was determined using the counterculture method on Petri dishes, with the growth inhibition zone of the test culture used as an indicator of antibiotic activity. Of the 23 antagonist strains, 20 showed antibiotic activity against at least one test culture, and 3 strains did not show antagonism against any of the test cultures. Using the analysis of variance, it was revealed that the antibiotic activity statistically significantly (p < 0.001) depended on the factors "antagonist strain", "test culture" and the interaction of the factors "antagonist strain" × "test culture" with the influence strength indices of 21.73 %, 17.99 and 42.32 %, respectively. On average, for the test cultures, the maximum antibiotic effect was shown by strains RSA16(1) and RSA20(2), while the minimum was shown by strains Hch.1 and CX5. The ability to suppress the growth of all test cultures without exception was demonstrated only by strains RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) and RSA20(2) (B. subtilis). Taking into account the average antibiotic activity for the test cultures, the use of strains RSA16(1) or RSA20(2) can be recommended for biological control of seed mold.
Brassica napus L., seed mold, Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., biological control, Bacillaceae family
Введение. Рапс (Brassica napus L.) широко используется в качестве пищевой, кормовой и технической культуры. При переработке семян рапса получают рапсовое масло, используемое как в кулинарии, так и в качестве биодизеля, а также высокобелковый жмых, используемый в качестве корма в животноводстве [1]. За последнее десятилетие мировое производство рапса выросло более чем на 20 %, сделав рапс второй по значимости масляничной культурой, на долю которой приходится более 12 % мирового производства растительного масла [2]. В Российской Федерации темпы роста производства рапса значительно превышают общемировые, а лидером среди субъектов федерации по посевным площадям под данной культурой является Красноярский край [3].
Одним из главных факторов, препятствующих полной реализации биологического потенциала рапса в плане урожайности, являются передающиеся через семена фитопатогенные грибы (главным образом представители родов Fusarium и Alternaria), а также возбудители плесневения семян р.р. Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Mucor. При этом возбудители плесневения семян, хотя формально и не являются фитопатогенами, поражают семена при хранении, значительно снижая их посевные качества, что позволяет отнести данные грибы к возбудителям болезней растений [4, 5].
Наиболее распространенным способом борьбы с возбудителями болезней рапса и других культур является предпосевное протравливание семян фунгицидами. Однако данный метод экологически небезопасен и ведет к повышению химической нагрузки на окружающую среду. Кроме того, во всем мире наблюдается неуклонный рост резистентности фитопатогенных микроорганизмов к применяемым химическим препаратам [6, 7]. Перспективной альтернативой химическим протравителям являются биопрепараты на основе штаммов-антагонистов возбудителей болезней [8]. При этом, по мнению ряда авторов, предпочтение следует отдавать биопрепаратам, созданным на основе комбинации штаммов-антагонистов [9, 10]. Ранее нами была продемонстрирована возможность использования выделенных из автохтонных почвенных и ризосферных микробных сообществ штаммов сем. Bacillaceae в качестве антагонистов актуальных для Красноярского края возбудителей грибных болезней рапса Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum и предложены комбинации этих штаммов для создания биопрепаратов широкого спектра действия [11].
Цель исследования – оценить антибиотическую активность различных представителей семейства Bacillaceae в отношении возбудителей плесневения семян рапса Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp.
Объекты и методы. В качестве антагонистов использовали выделенные нами из почвенных и ризосферных сообществ Красноярского края штаммы Bacillus altitudinis RSA2, Bacillus atrophaeus RSA9, RSA19, СХ6, RSA1 (запатентован авторами под номером B-13893), RSA8, RSA16(1), RSA16(2), RSA18, Bacillus cereus АЛ3, СХ5, Bacillus megaterium RSA4, Bacillus simplex RSA15, Bacillus subtilis RSA17, RSA20(1), RSA20(2), RSA11, Bacillus sp. Ра1, Ра2, Ра3, Ал4, Хч.1 и Peribacillus simplex RSA12. Выбор данных штаммов обусловлен тем, что в предыдущих исследованиях они показали высокую антибиотическую активность против фитопатогенных грибов – возбудителей болезней ярового рапса Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria spp. и Fusarium spp. [11, 12].
В качестве тест-культур использовали изоляты Fusarium sp., Aspergillus sp., Mucor sp. и два различающихся на уровне принадлежности к разным видам изолята Penicillium sp. Указанные изоляты были выделены нами из пораженных плесневыми грибами семян рапса сорта Надежный 92 производства федерального государственного унитарного предприятия «Михайловское» (Красноярский край, Ужурский район), урожай 2023 г. Проверку антибиотической активности изучаемых штаммов в отношении возбудителей плесневения семян выполняли методом двойных (встречных) культур (dual culture assay) по ширине зоны отсутствия роста тест-культуры в присутствии штамма-антагониста [12, 13] (рис. 1). В качестве питательной среды, хорошо поддерживающей рост как изучаемых штаммов, так и мицелиальных грибов, использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в два раза и дополненную агаром до 20 г/л [12, 14]; время инкубирования составляло 10 сут, температура инкубирования (25 ± 1) °C; повторность трехкратная.
Статистическую обработку результатов проводили двухфакторным дисперсионным анализом, факторами служили тест-культура гриба и штамм бактерий-антагонистов. В качестве post hoc тестов для парного сравнения индивидуальных средних после проведения дисперсионного анализа использовали тесты Шеффе и Тьюки [15]; в качестве программного обеспечения использовали математический пакет StatSoft STATISTICA 8.0.
Рис. 1. Метод встречных культур на примере изолята Mucor sp.:
1 – рост гриба в контроле; 2 – в присутствии штамма-антагониста RSA16(2)
Counterculture method using the Mucor sp. isolate as an example:
1 – fungal growth in the control; 2 – in the presence of the antagonist strain RSA16(2)
Результаты и их обсуждение. Из 23 протестированных штаммов 3 не проявили антибиотической активности в отношении тест-культур, остальные 20 ингибировали рост как минимум одной тест-культуры; при этом уровень антибиотической активности зависел как от тест-культуры, так и от штамма (табл. 1, рис. 2, 3).
Таблица 1
Зоны подавления роста тест-культур в присутствии изучаемых штаммов
(представлены данные, усредненные по трем повторностям),мм
Zones of growth inhibition of test cultures within the studied strains
(data are presented, averaged over three repetitions), mm
|
Штамм |
Тест-культура |
||||
|
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium |
Mucor sp. |
||
|
изолят 1 |
изолят 2 |
||||
|
RSA1 |
7,00 |
7,00 |
11,33 |
0,00 |
10,33 |
|
RSA2 |
10,00 |
0,00 |
9,81 |
21,00 |
0,00 |
|
RSA8 |
1,33 |
10,00 |
14,00 |
0,00 |
10,33 |
|
RSA9 |
10,67 |
4,67 |
7,00 |
0,00 |
9,00 |
|
RSA11 |
9,67 |
12,00 |
12,00 |
0,00 |
15,33 |
|
RSA15 |
0,00 |
5,33 |
10,00 |
0,00 |
6,00 |
|
RSA16(1) |
15,00 |
12,00 |
9,33 |
11,00 |
13,00 |
|
RSA16(2) |
13,67 |
9,33 |
0,00 |
0,00 |
15,67 |
|
RSA17 |
13,00 |
12,00 |
13,00 |
0,00 |
15,00 |
|
RSA18 |
0,00 |
9,00 |
14,00 |
0,00 |
4,33 |
|
RSA19 |
12,33 |
8,33 |
10,00 |
0,00 |
11,33 |
|
RSA20(1) |
8,00 |
11,67 |
11,00 |
7,00 |
10,00 |
|
RSA20(2) |
11,67 |
10,00 |
17,33 |
3,67 |
13,33 |
|
Хч.1 |
3,00 |
0,00 |
4,67 |
0,00 |
0,00 |
|
CХ5 |
0,00 |
11,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
|
СХ6 |
13,33 |
0,00 |
10,33 |
3,67 |
11,33 |
|
АЛ3 |
13,67 |
4,00 |
12,00 |
0,00 |
10,67 |
|
АЛ4 |
12,67 |
11,00 |
12,33 |
0,00 |
8,33 |
|
Ра3 |
8,67 |
0,00 |
8,33 |
0,00 |
0,00 |
Статистическая значимость влияния факторов «тест-культура», «штамм бактерий», а также эффекта взаимодействия факторов «тест-культура» × «штамм бактерий» составила p < 0,001; соответствующие показатели силы влияния равны 17,99 %; 21,73; и 42,32 %; на долю случайного варьирования пришлось 17,95 %. Таким образом, основной вклад в варьирование зоны отсутствия роста внесли индивидуальные особенности воздействия штаммов на конкретные тест-культуры.
Рис. 2. Зависимость зоны подавления роста тест-культуры
(на примере изолята Aspergillus sp.) от штамма-антагониста:
1 – штамм RSA20(1), видна ярко выраженная зона отсутствия роста тест-культуры;
2 – штамм СХ5, зона отсутствия роста тест-культуры не выражена
Dependence of the test culture growth inhibition zone
(using an Aspergillus sp. isolate as an example) on the antagonist strain:
1 – strain RSA20(1), a clearly visible zone of test culture growth inhibition is visible;
2 – strain CX5, the zone of test culture growth inhibition is not clearly visible
Рис. 3. Зависимость антибиотической активности штаммов-антагонистов (на примерештамма RSA8) от тест-культуры:
1 – тест-культура Fusarium sp., зона отсутствия роста тест-культуры ярко выражена; 2 – тест-культура Aspergillus sp., зона отсутствия роста тест-культуры выражена слабо
Dependence of the antibiotic activity of antagonist strains
(using the RSA8 strain as an example) on the test culture:
1 – Fusarium sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is clearly expressed;
2 – Aspergillus sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is weakly expressed
В среднем по использованным в работе изолятам возбудителей плесневения семян максимальный антифунгальный эффект показали штаммы RSA16(1) и RSA20(2), минимальный – штаммы Хч.1 и СХ5 (рис. 4).
Рис. 4. Средняя по изолятам возбудителей плесневения семян зона отсутствия роста
тест-культур в присутствии штаммов-антагонистов, мм
Average zone of no growth of test cultures in the presence of antagonist strains for isolates
of seed mold pathogens, mm
При этом способность подавлять рост всех без исключения тест-культур продемонстрировали только штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis).
Среди тест-культур максимальную чувствительность к набору изученных штаммов проявил Penicillium sp. (изолят 1), минимальную – Penicillium sp. (изолят 2) (рис. 5).
Рис. 5. Средняя по штаммам-антагонистам зона отсутствия роста у разных тест-культур, мм
Average zone of no growth for antagonist strains in different test cultures, mm
Тесты Шеффе и Тьюки показали, что статистически значимые различия по средней чувствительности к штаммам-антагонистам наблюдаются между Penicillium sp. (изолят 2) и всеми остальными тест-культурами, а также между Penicillium sp. (изолят 1) и Fusarium sp. (табл. 4, 5).
Таблица 4
Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней
чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Шеффе (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой)
Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set
of studied strains using the Scheffe test (numbers in cells indicate the statistical significance
of differences (p) rounded to three decimal places)
|
Тест-культура |
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium sp. |
|
|
изолят 1 |
изолят 2 |
|||
|
Aspergillus sp. |
0,247 |
0,395 |
0,000 |
|
|
Fusarium sp. |
0,247 |
0,001 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 1) |
0,395 |
0,001 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 2) |
0,000 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Mucor sp. |
1,000 |
0,235 |
0,411 |
0,000 |
Таблица 5
Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней
чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Тьюки (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой)
Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set
of studied strains using the Tukey test (numbers in cells indicate the statistical significance
of differences (p) rounded to three decimal places)
|
Тест-культура |
Aspergillus sp. |
Fusarium sp. |
Penicillium sp. |
|
|
изолят 1 |
изолят 2 |
|||
|
Aspergillus sp. |
0,133 |
0,254 |
0,000 |
|
|
Fusarium sp. |
0,133 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 1) |
0,254 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Penicillium sp. (изолят 2) |
0,000 |
0,000 |
0,000 |
|
|
Mucor sp. |
1,000 |
0,124 |
0,268 |
0,000 |
Полученные результаты можно интерпретировать следующим образом. Изученные штаммы-антагонисты выделяют не одно антибиотическое вещество, а набор подобных веществ. При этом конкретный состав набора зависит от штамма. В то же время чувствительность возбудителей плесневения семян к разным антибиотическим веществам из этого набора определяется видовой принадлежностью возбудителя. Данные результаты хорошо согласуются с результатами аналогичного исследования, проведенного нами на наборе фитопатогенных грибов – возбудителей болезней рапса [10].
Заключение. На основе изучения антибиотической активности 23 штаммов сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, в отношении 4 таксономически различающихся возбудителей плесневения семян рапса установлено, что лишь 3 штамма проявили способность подавлять рост всех без исключения тест-культур. Такую способность продемонстрировали штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis). С учетом средней по тест-культурам антибиотической активности для биологической борьбы с плесневением семян можно рекомендовать использование штаммов RSA16(1) или RSA20(2).
1. Raboanatahiry N, Li H, Yu L, et al. Rapeseed (Brassica napus): Processing, Utilization, and Genetic Improvement. Agronomy. 2021;11:1776. DOI:https://doi.org/10.3390/agronomy11091776.
2. Zheng Q, Liu K. Worldwide rapeseed (Brassica napus L.) research: A bibliometric analysis during 2011–2021. Oil Crop Science. 2022;7(4):157-165, DOI:https://doi.org/10.1016/j.ocsci.2022.11.004.
3. Rosstat – Federal State Statistics Service. Bulletin “Cultivated areas of the Russian Federation in 2024 (spring accounting).” Available at: https://rosstat.gov.ru/compendium/document/13277. Accessed: 17.07.2024.
4. Grigoriev EV, Postovalov AA. Reaction of spring rapeseed to the treatment of crops with liquid mineral fertilizers. Bulletin of the Ulyanovsk State Agricultural Academy. 2018;1:60-63. DOI:https://doi.org/10.18286/1816-4501-2018-1-60-63.
5. Abolentseva PA, Khizhnyak SV, Khalipsky AN, et al. Taxonomic composition and prevalence of infection of spring rape seeds in the Krasnoyarsk territory. Bulletin of KSAU. 2023;12:111-120. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2023-12-111-120
6. Hollomon DW. Fungicide Resistance: 40 Years on and Still a Major Problem. In: Ishii H, Hollomon D, editors. Fungicide Resistance in Plant Pathogens. 2015. Springer, Tokyo. DOI:https://doi.org/10.1007/978-4-431-55642-8_1
7. Thind TS. New insights into fungicide resistance: a growing challenge in crop protection. Indian Phytopathology. 2022;75(4):927-939.
8. Butu M, Stef R, Grozea I, et al. Biopesticides: Clean and Viable Technology for Healthy Environment. Bioremediation and Biotechnology. 2020:107-151. DOI:https://doi.org/10.1007/978-3-030-35691-0_6.
9. Niu B, Wang W, Yuan Z, et al. Microbial interactions within multiple-strain biological control agents impact soil-borne plant disease. Frontiers in Microbiology. 2020;11:585404.
10. Maciag T, Kozieł E, Rusin P, et al. Microbial Consortia for Plant Protection against Diseases: More than the Sum of Its Parts. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(15):12227.
11. Khizhnyak SV, Abolentseva PA, Ovsyankina SV, et al. Multidimensional statistical methods as a tool in the selection of antagonist strains for biological protection of plants from diseases. Bulletin of KSAU. 2024;4:36-45. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2024-4-36-45.
12. Abolentseva PA, Khizhnyak SV, Ovsyankina SV, et al. Effectiveness of representatives of the family. Bacillaceae isolated from agricultural soils of the Krasnoyarsk territory, against pathogens of fungal diseases of potatoes. Bulletin of KSAU. 2024;3:3-10. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2024-3-3-10.
13. Kim WG, Weon HY, Seok SJ, et al. In vitro antagonistic characteristics of bacilli isolates against Trichoderma sp. and three species of mushrooms. Mycobiology. 2008;36(4):266-269.
14. Rodovikov SA, Churakov AA, Popova NM, et al. Soil microbial communities as a source of strains for biological protection of soybeans from fusarium in Yenisei Siberia. Bulletin of Nizhnevartovsk State University. 2020;2:4-11.
15. Midway S, Robertson MD, Flinn S, et al. Comparing multiple comparisons: practical guidance for choosing the best multiple comparisons test. PeerJ. 2020;8:e10387. DOI:https://doi.org/10.7717/peerj.10387.
