Federal State Budgetary Scientific Institution "Federal Scientific Center for Agroecology, Integrated Reclamation and Protective Afforestation of the Russian Academy of Sciences" (Biotechnology Laboratory, leader researcher, head of the Biotechnology Laboratory)
Volgograd, Volgograd, Russian Federation
VAK Russia 4.1.2
VAK Russia 4.1.3
VAK Russia 4.1.4
VAK Russia 4.1.5
VAK Russia 4.2.1
VAK Russia 4.2.2
VAK Russia 4.2.3
VAK Russia 4.2.4
VAK Russia 4.2.5
VAK Russia 4.3.3
VAK Russia 4.3.5
UDC 631.529
UDC 581.143.6
The aim of the study is to assess the effect of simulated osmotic stress in vitro culture on the morphophysiological and anatomical parameters of the foliar apparatus of the selected genotypes of woody and shrubby plants. The studies were conducted at the Laboratory of Biotechnology of the FSC of Agroecology of the RAS in 2023–2024. The objects of the study were three species of woody and shrubby plants that are promising in arid climates: Cotinus coggygria Scop. (Cotinus coggygria Scop.), dwarf rootstock for stone fruits Prunus VSL 2, Caragana pygmaea L. (Dwarf caragana). Drought conditions were simulated using a non-ionic osmotic agent polyethylene glycol with a molecular weight of 6000 (PEG). Osmotic stress in the nutrient medium had an inhibitory effect on the growth processes of all studied species. However, the nature of the changes was species-specific. General changes in leaf blades were manifested in a decrease in the size of stomatal cells, complete or partial closure of the stomatal slit and a higher density of stomata. After cultivation on a medium with PEG 60 g/l, the leaf blade area of C. coggygria decreased by 3.8 times, for Prunus VSL 2 leaves – by 1.2 times compared to the control. When cultivating on nutrient media supplemented with PEG 60 g/l, only regenerants of C. pygmaea capable of rhizogenesis survived. One of the criteria for selecting more drought-resistant genotypes is the chlorophyll content in leaf blades, reflecting the stable operation of the photosynthetic apparatus. For C. pygmaea, this indicator was 2.5 times lower than the control. In Prunus VSL 2 and Cotinus coggygria adapted to water deficit, the total chlorophyll content in leaf blades was higher.
drought resistance of tree and shrub species, polyethylene glycol, osmotic stress, in vitro, stomata, chlorophyll
Введение. Проблемы опустынивания территорий, деградации и разрушения почв требуют ответных мер реагирования, и в первую очередь это необходимость вовлечения в защитные лесонасаждения новых, адаптированных к экстремальным почвенно-климатическим условиям генотипов древесно-кустарниковых видов.
Древесные растения реализуют свой адаптивный потенциал через изменения, происходящие на разных уровнях организации. Высокая степень чувствительности и изменчивости морфологических и анатомических признаков отмечается в листовых пластинах, которая отражает приспособительные механизмы отдельных генотипов к лимитирующим факторам окружающей среды [1, 2].
Исследования параметров листьев в популяциях Betula pendula Roth. показали, что с усилением аридности климата увеличивались толщина и плотность листа, что способствовало функциональным изменениям листового аппарата. Данные параметры предложили использовать как маркерные признаки, отражающие адаптацию фотосинтетического аппарата к изменению климатических условий [3]. Содержание хлорофилла в листьях также зависит от величины влагообеспеченности и используется как показатель отзывчивости на увлажнение и устойчивость к засухе [4, 5]. Достоверное снижение фотосинтетической активности под влиянием засухи и засоления было отмечено у генотипов пшеницы [6]. Сравнение реакции сортов овса на почвенную засуху также проводили с учетом изменения хлорофиллового индекса [7].
Использование современных технологий и лабораторных методов скрининга стрессоустойчивых генотипов в последнее время становится альтернативным и эффективным способом получения потенциально улучшенного селекционного материала. Многие исследования подтверждают сопоставимость результатов тестирования растительных тканей in vivo и in vitro, которые позволяют определить критерии отбора устойчивых растений и ускорить реализацию селекционных программ [8]. Скрининг растений, культивируемых in vitro, на засухоустойчивость с применением различных стресс-индуцирующих агентов описан во многих исследованиях [9].
Цель исследований – оценка влияния моделируемого осмотического стресса в культуре in vitro на морфофизиологические и анатомические показатели листового аппарата отобранных генотипов древесно-кустарниковых растений.
Объекты и методы. Работа проводилась на базе лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН в 2023–2024 гг. Объектами исследований были выбраны три вида древесно-кустарниковых растений, перспективных в условиях засушливого климата: Cotinus coggygria Scop. (скумпия кожевенная) – небольшое лиственное дерево или крупный кустарник; карликовый подвой для косточковых Prunus fruticosa × Prunus serrulata var. Lannesiana (cv. Prunus VSL 2); Caragana pygmaea L. (карагана карликовая) – кустарник 0,5–1 м, чаще всего встречается на песчаных участках и каменистых склонах.
Условия засухи смоделированы с использованием неионного осмотика полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ). Лабораторные испытания показали, что критической концентрацией ПЭГ в питательной среде являлась 60 г/л, что подтверждается и на других объектах [10]. Для культивирования микропобегов исследуемых растений использовали питательную среду по протоколу Мурасиге и Скуга (MS) без добавления гормонов. После 45 дней анализировали морфометрические показатели листовых пластин (площадь, масса, наличие увядания, скручивания или хлороза). Для оценки устьичного аппарата листьев проводили микроскопирование отделенной от мезофилла нижней эпидермы листа. Содержание пигментов в листьях (хлорофилла и каротиноидов) у регенерантов на культуральной среде с ПЭГ 60 г/л по сравнению с контролем (среда MS без ПЭГ) определяли при помощи спектрофотометра SPECTROstarNANO по ранее апробированной методике [11].
Обработку полученных результатов проводили при помощи пакета MS Excel. Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни (p ˂ 0,05).
Результаты и их обсуждение. ПЭГ-индуцированный водный дефицит в питательной среде оказывал ингибирующее действие на ростовые процессы всех исследуемых видов. Однако характер изменений носил видоспецифичные реакции. Все экспланты C. coggygria и Prunus VSL 2 после 8 недель культивирования на среде с ПЭГ 60 г/л были жизнеспособны, несмотря на отсутствие процессов ризогенеза. Для регенерантов C. pygmaea отличительной чертой являлось наличие слаборазвитой корневой системы у 45 % микропобегов в условиях осмотического стресса, которые оставались жизнеспособными, неукорененные экспланты погибли. На 7–14-е сутки у эксплантов C. coggygria и C. pygmaea наблюдался хлороз листовых пластин и в некоторых случаях их опадение, при этом происходило формирование новых листочков (рис. 1). У регенерантов C. coggygria они имели более темную окраску и плотность, для C. pygmaea листочки сильно сближенные, на концах черешков отличались признаками витрификации.
Рис. 1. Микропобеги исследуемых видов после 7 недель культивирования:
A – Prunus VSL 2 на среде MS, контроль; B – Cotinus coggygria на среде MS,
C – Caragana pygmaea на среде MS, контроль; D – Prunus VSL 2, ПЭГ 60 г/л;
E – Cotinus coggygria, ПЭГ 60 г/л; контроль; F – Caragana pygmaea, ПЭГ 60 г/л
Micro shoots of the studied species after 7 weeks of cultivation:
A – Prunus VSL 2 on MS environment, control; B – Cotinus coggygria on MS environment,
C – Caragana pygmaea on MS medium, control; D – Prunus VSL 2, PEG 60 g/l;
E – Cotinus coggygria, PEG 60 g/l; control; F – Caragana pygmaea, PEG 60 g/l
Для микропобегов Prunus VSL 2 было характерно скручивание листовых пластин и потеря упругости, что обычно способствует предотвращению обезвоживания [12]. Образование новых листьев практически отсутствовало, хлороз присутствовал частично, по краям листовых пластин первичных эксплантов (см. рис. 1, D).
Листья C. coggygria и Prunus VSL 2 очередные, простые, с примерно одинаковыми значениями площади листовых пластин на питательной среде без добавления осмотика (табл. 1). После культивирования на среде с ПЭГ 60 г/л у C. coggygria площадь листовых пластин уменьшилась в 3,8 раза и составила 9,79 мм2, для листьев Prunus VSL 2 снижение данного показателя было незначительное в – 1,2 раза по сравнению с контролем, что объясняется обновлением листовых пластин у C. coggygria, вновь сформированные были значительно мельче, а у Prunus VSL 2 происходило постепенное скручивание листьев, что незначительно повлияло на уменьшение площади. Прямая зависимость от значений площади листовых пластин была характерна и для изменения их массы.
Таблица 1
Параметры листовых пластин Cotinus coggygria и Prunus VSL 2
Parameters of Cotinus coggygria and Prunus VSL 2 leaf plates
|
Показатель |
Cotinus coggygria |
Prunus VSL-2 |
||
|
Контроль |
ПЭГ 60 г/л |
Контроль |
ПЭГ 60 г/л |
|
|
Площадь листовой пластины, мм2 |
37,53±3,34 a |
9,79±1,11 b |
43,25±4,06 a |
35,56±3,65 b |
|
Масса листовой пластины, мг |
5,64±0,35 a |
1,25±0,09 b |
6,46±0,55 a |
4,17±0,59 b |
|
Кол-во устьичных клеток, шт/0,1 мм2 |
36,24±2,55 b |
46,04±2,58 a |
21,79±1,39 b |
26,99±1,57 a |
Примечание. В таблице представлены средние значения ± ошибка среднего, различные буквы (здесь и далее) между контролем и ПЭГ 60 г/л означают статистические различия, согласно критерию Манна-Уитни, при p ˂ 0,05.
Микроскопирование нижней эпидермы листьев у всех трех видов позволило оценить особенности устьичного аппарата и его изменения при осмотическом стрессе. Формирование и развитие устьиц в листовых пластинах является генетически регулируемым процессом, но плотность устьиц, их размер и форма являются гибкой системой адаптации растений к различным факторам окружающей среды [12]. Несмотря на индивидуальные особенности размеров и расположения устьичных клеток у исследуемых видов, в условиях моделируемой засухи характерными чертами для всех листовых пластин было уменьшение размеров устьичных клеток, полное или частичное смыкание устьичной щели, но при этом общее количество устьиц возрастало (рис. 2). Лист с множеством мелких устьиц может снизить потенциальную проводимость и повысить эффективность использования воды [13].
На рисунке 2 (A–C) наглядно представлено постепенное уменьшение размеров устьиц и смыкание устьичных щелей Prunus VSL 2 при длительном воздействии осмотического стресса в культуре in vitro. Для данного вида характерны крупные устьица (см. рис. 2, D) площадью 553,3 мкм2, с открытыми устьичными щелями на контрольной среде, после культивирования на среде с ПЭГ площадь устьиц сократилась в 2 раза, а площадь устьичной щели после 8 недель ПЭГ-индуцированного стресса уменьшилась в 8,5 раза, некоторые из них были практически закрыты (см. рис. 2, C; рис. 3). Листья C. coggygria отличались самыми маленькими по площади устьицами при их высокой плотности, которые уменьшались в 1,4 раза под действием осмотического стресса. Устьичная щель смыкалась в 2,4 раза, что в 3,5 раза меньше, чем у Prunus VSL 2, и в 6,3 раза меньше, чем у C. pygmaea. Равномерное распределение на внутренней поверхности листа устьиц площадью 321,9 мкм2, которая уменьшилась как и у C. coggygria, в 1,4 раза под влиянием ПЭГ, и смыкание устьичной щели в 15,8 раза были характерны для C. pygmaea (см. рис. 2, F; рис. 3).
|
A |
|
F |
|
E |
|
D |
|
C |
|
B |
Рис. 2. Устьичные клетки при микроскопировании нижней эпидермы листьев:
A–C – смыкание устьичной щели у Prunus VSL 2 на контроле (A), через 4 недели культивирования на ПЭГ 60 г/л (B), через 8 недель культивирования на ПЭГ 60 г/л (C); D – устьичные клетки Prunus VSL 2, контроль; E – устьичные клетки Cotinus coggygria, контроль; F – устьичные клетки Caragana pygmaea, контроль
Stomatal cells during microscopy of the lower epidermis of leaves:
A–C – closure of the stomatal fissure in Prunus VSL 2 on control (A), after 4 weeks of cultivation on PEG 60 g/l (B), after 8 weeks of cultivation on PEG 60 g/l (C); D – stomatal cells of Prunus VSL 2, control; E – stomatal cells of Cotinus coggygria, control; F – stomatal cells of Caragana pygmaea, control
Рис. 3. Характеристика устьичных клеток при моделировании осмотического стресса
в культуре in vitro
Characterization of stomatal cells during osmotic stress modeling in in vitro culture
Сравнительный анализ содержания пигментов, влияющих на работу фотосинтетической системы, в контрольной группе и подверженных осмотическому стрессу листовых пластинах трех изученных видов позволил определить зависимость между этим показателем и толерантностью к моделируемой засухе in vitro. В листовых пластинах C. coggygria количество общего хлорофилла под влиянием ПЭГ возросло в 1,9 раза по сравнению с контролем, статистически значимые различия содержания каротиноидов отсутствовали (табл. 2). Такие изменения говорят об успешной адаптации сформированных под влиянием осмотического стресса листовых пластин, меньших по площади, утолщенных, с высокой плотностью небольших по размеру устьиц, что в совокупности обеспечило стабильную работу фотосинтетического аппарата и способность адаптироваться к условиям водного дефицита. Такие же изменения претерпевали и некоторые другие виды в условиях осмотического стресса [7, 10, 14].
Таблица 2
Содержание фотосинтетических пигментов в листовых пластинах
The content of photosynthetic pigments in leaf plates
|
Вид |
Концентрация ПЭГ в среде |
Общий хлорофилл, мкг/см2 |
Каротиноиды, мкг/см2 |
|
Caragana pygmaea |
Контроль, 0 г/л |
13,80±2,72 a |
3,13±0,60 a |
|
ПЭГ 60 г/л |
5,36±1,03 b |
1,19±0,20 b |
|
|
Cotinus coggygria |
Контроль, 0 г/л |
12,14±0,55 b |
1,59±0,12 a |
|
ПЭГ 60 г/л |
22,85±1,90 a |
3,78±0,39 a |
|
|
Prunus VSL-2 |
Контроль, 0 г/л |
13,97±1,27 a |
1,89±0,22 b |
|
ПЭГ 60 г/л |
20,18±2,48 a |
3,15±0,39 a |
Скручивание листьев Prunus VSL-2 и наличие признаков хлороза по краю способствовали увеличению содержания каротиноидов в 1,6 раза по сравнению с контролем. Содержание общего хлорофилла было выше, чем на контроле, статистически значимые различия отсутствовали, что характеризует отсутствие изменений в работе фотосинтетического аппарата. У C. pygmaea листья парноперистые, выглядят как пальчатые, в культуре in vitro очень мелкие, большая часть была подвержена хлорозу, что затрудняло работу. Осмотический стресс оказал ингибирующее действие на содержание общего хлорофилла, который снизился в 2,5 раза по сравнению с контролем. Концентрация каротиноидов также была меньше. Общее снижение содержания фотосинтетических пигментов характеризует низкую адаптацию листового аппарата к условиям осмотического стресса у C. pygmaea.
Полученные данные позволяют оценить адаптивный потенциал листовых пластин изученных видов в условиях осмотического стресса и спрогнозировать ответную реакцию растений на засуху. C. coggygria и Prunus VSL-2 обладают высокой способностью адаптироваться к моделируемой засухе, C. pygmaea более чувствительна к водному дефициту.
Заключение. Осмотический стресс в культуре in vitro, индуцированный полиэтиленгликолем, оказывал ингибирующее действие на ростовые процессы микропобегов всех изученных видов. Общие изменения в листовых пластинах проявлялись в уменьшении размеров устьичных клеток, полном или частичном смыкании устьичной щели и более высокой плотности устьиц. Для C. coggygria характерными признаками адаптации к водному дефициту являются хлороз, опадение листьев первичного экспланта и формирование новых, меньших по площади листовых пластинок, утолщенных, с погруженными устьицами. У микропобегов Prunus VSL-2 листья скручивались, проявлялся хлороз по краю, новые листья практически не формировались, происходило смыкание устьичной щели. При культивировании на питательных средах, дополненных ПЭГ 60 г/л, выжили только способные к ризогенезу регенеранты C. pygmaea.
В качестве одного из оптимальных критериев отбора более засухоустойчивых генотипов можно использовать показатель содержания хлорофилла в листовых пластинах, отражающий стабильную работу фотосинтетического аппарата. Для C. pygmaea, после 8 недель культивирования, не все регенеранты были жизнеспособны, и этот показатель был ниже контроля.
1. Liu W, Zheng L, Qi D. Variation in leaf traits at different altitudes reflects the adaptive strategy of plants to environmental changes. Ecology and Evolution. 2020;10(15):8166–8175. DOI:https://doi.org/10.1002/ece3.6519. EDN: https://elibrary.ru/VFGZTT.
2. Kuznetsova TA. Adaptations of the leaf surface of black currants depending on the conditions of water supply. Regional Geosystems. 2015;31(9):29–36. EDN: https://elibrary.ru/UHUPMP.
3. Migalina SV, Ivanov LA, Ivanova LA. Changes in leaf functional parameters of species from genus Betula along the gradient of climate aridity in Southern Siberia and Mongolia. Problems of botany of South Siberia and Mongolia. 2019;18(1):516–519. DOI:https://doi.org/10.14258/pbssm.2019108. EDN: https://elibrary.ru/PXQHBW.
4. Gaze VL, Golubova VA, Lobunskaya IA. Leaf surface index as an indicator of moisture responsiveness and drought resistance of winter bread wheat samples. Grain Economy of Russia. 2021;6:9–14. DOI:https://doi.org/10.31367/2079-8725-2021-78-6-9-14. EDN: https://elibrary.ru/NWDFDL.
5. Tkachev EN, Tsukanova EM. Methods for Monitoring the Effects of Abiotic Stressors in Apple Tree Plantings. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2019;33(2):17–21. DOI:https://doi.org/10.24411/0235-2451-2019-10205. EDN: https://elibrary.ru/ZBALRJ.
6. Stupko VYu, Zobova NV, Gayevsky NA. Comparison of screening study methods of wheat leaf response to the osmotic stress. Mechanisms of resistance of plants and microorganisms to unfavorable environmental. 2018;8:733–737. DOI:https://doi.org/10.31255/978-5-94797-319-8-733-737. EDN: https://elibrary.ru/XWSEYX.
7. Eremin DI, Lubimova AV, Eremina DV. Evaluation of the oats varietal reaction to soil drought by the chlorophyll index. Bulletin of KSAU. 2023;11:87–97. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2023-11-87-97. EDN: https://elibrary.ru/KXSDMV.
8. Terletskaya N, Kurmanbayeva M, Erezhetova U. Morphophysiological and Photosynthetic Reactions of Wheat (T. aestivum L.) and Its Wild Congeners to Drought Condition In Vivo and In Vitro. Recent Advances in Grain Crops Research. IntechOpen. 2019. P. 45–73. DOI:https://doi.org/10.5772/intechopen.86340.
9. Razavizadeh R, Farahzadianpoor F, Adabavazeh F, et al. Physiological and morphological analyses of Thymus vulgaris L. in vitro cultures under polyethylene glycol (PEG)-induced osmotic stress. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2019;55:342–357. DOI:https://doi.org/10.1007/s11627-019-09979-1. EDN: https://elibrary.ru/GKDMZK.
10. Vuksanović V, Kovacevic B, Orlovic S, et al. The influence of drought on growth and development of white poplar shoots in vitro. Topola. 2019;203:13–18.
11. Staruhina AO, Popova AS, Zaitsev VG. The Quantification of Chlorophylls and Carotenoids in the Same Sample of an Individual Condition Assessment of Agricultural Plant’s Seedlings. Scientific Agronomy Journal. 2021;2:18–22. DOI:https://doi.org/10.34736/FNC.2021.113.2.002.18-22. EDN: https://elibrary.ru/BTRJQX.
12. Zuch DT, Doyle SM, Smith RS, et al. Cell biology of the leaf epidermis: Fate specification, morphogenesis, and coordination. The Plant Cell. 2022;34:209–227. DOI:https://doi.org/10.1093/plcell/koab250. EDN: https://elibrary.ru/VZIXDK.
13. Fraser LH, Greenall A, Carlyle C, et al. Adaptive phenotypic plasticity of Pseudoroegneria spicata: response of stomatal density, leaf area and biomass to changes in water supply and increased temperature. Annals of Botany. 2009;103(5):769–775. DOI:https://doi.org/10.1093/aob/mcn252.
14. Erst AA, Karakulov AV. Drought tolerance of ornamental Poplar forms cultured in vitro. Contemporary Problems of Ecology. 2023;16(3):339–345. DOI:https://doi.org/10.1134/S1995425523030058. EDN: https://elibrary.ru/SZFWEB.
