Введение. Клостридии относятся к роду Clostridium, семейству Clostridiaceae, порядку Clostridiales, классу Clostridia, отряду Fermicutes. Болезни, вызываемые клостридиями, условно подразделяют на три основных типа: нейротоксические, гистотоксические и кишечные [1, 2].
Патогенными клостридиями, оказывающими наибольший ущерб животноводству, являются C. chauvoei (эмфизематозный карбункул), C. novyi (C. oedematiens) тип А, C. septicum, C. sordellii (злокачественный отек), C. haemolyticum (C. novyi тип D) (бациллярная гемоглобинурия), C. perfringens тип А и D (злокачественный отек, газовая гангрена, некротизирующие энтериты, метриты, мастит), C. septicum, C. oedematiens (C. novyi), C. histolyticum (злокачественный отек, брадзотоподобные инфекции) и C. difficile (некротические энтериты, диареи) [3].
Помимо описанных выше видов клостридий, от крупного рогатого скота выделяют и другие, многие из которых при благоприятных условиях могут синтезировать экзотоксины и вызывать соответствующую патологию. Поэтому для диагностики клостридиозов крупного рогатого скота необходимо проводить видовую идентификацию выделенных бактериальных культур.
В настоящее время в России основным методом видовой идентификации выделенных культур клостридий является определение их фенотипических и биохимических свойств [4, 5]. Для окончательной идентификации клостридий необходимо проводить дополнительные тесты, усложняющие и увеличивающие сроки ее проведения [6, 7].
Методы дифференциации возбудителей, основанные на выявлении генов, специфических для каждого вида микроорганизмов в образце, лишены этого недостатка. В настоящее время разработаны различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления отдельных видов клостридий и типирования выделенных изолятов по факторам токсигенности [1, 8].
Цель исследования – разработка метода видовой идентификации 7 видов клостридий: C. sporogenes, C. perfringens, C. sordellii, C. histolyticum, C. septicum, C. chauvoei и C.novyi – при помощи мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Объекты и методы. Работа выполнена в 2021–2024 гг. в лаборатории биотехнологии диагностического центра Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СФНЦА РАН.
Бактериологические исследования проводили согласно ГОСТ 26503-85 «Методы лабораторной диагностики клостридиозов».
Видовую идентификацию бактериальных культур по ферментативным свойствам проводили с использованием «Набора для идентификации анаэробных бактерий АНАЭРОтест 23» производства Erba Mannheim (Чехия).
Для исследования в ПЦР в реальном времени отбирали отдельные колонии выросших бактерий. Суммарную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора «Ампли Прайм РИБО-сорб» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Амплификацию проводили в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США). Температурный режим проведения ПЦР: 95 °С – 5 мин – 1 цикл; 95 °С – 15 с, 55 °С – 30 с, 72 °С – 30 с – 45 циклов.
В качестве положительного контроля ПЦР использовали изоляты C. septicum, C. histolyticcum, C. perfringens, C. sordelli, C. novyi, C. sporogenes, охарактеризованные по культуральным и биохимическим свойствам. Для определения аналитической чувствительности реакции – искусственно синтезированные положительные контрольные образцы (ПКО). Специфичность амплификации проверяли с культурами других микроорганизмов.
Результаты и их обсуждение. В период с 2021 по 2024 г. исследовали 510 проб биологического материала от животных разных половозрастных групп из 32 хозяйств Иркутской, Кемеровской, Новосибирской, Омской, Тюменской областей, Алтайского края с клиническими проявлениями клостридиозов, описанных нами ранее [7].
Из органов больных животных чаще изолировали C. perfringens, C. histolyticum и реже – C. septicum, C. sporogenes, C. sordellii и C. novyi.
По фенотипическим и биохимическим свойствам идентифицировали 50 изолятов клостридий, которые были использованы в дальнейшей работе при разработке мультиплексной ПЦР.
Нами был проведен анализ нуклеотидных последовательностей геномов бактерий C. sporogenes, C. perfringens, C. sordellii, C. histolyticum, C. septicum, C. chauvoei и C.novyi из базы данных NCBI (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и определены наиболее консервативные участки геномов. Поиск олигонуклеотидных праймеров и зондов проводили с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax). Для идентификации генетического материала каждого из семи видов клостридий подобрали по три различных варианта праймеров и зондов, из которых выбрали наиболее специфичные [9].
Диагностическую чувствительность определили с помощью титрования суточных культур каждого изолята методом серийных разведений, а аналитическую – ПКО (табл., рис.).
Аналитическая и диагностическая чувствительность при исследовании
10-кратных разведений культур бактерий и ПКО
|
Вид бактерии |
Аналитическая чувствительность |
Диагностическая чувствительность |
||
|
Минимально определяемая концентрация ПКО (ГЭ в реакции) |
Значение Ct в последнем разведении, детектируемом положительно (среднее Ct ± S.D.) |
Минимально определяемая концентрация бактерий, КОЕ/мл |
Значение Ct в последнем разведении, детектируемом положительно (среднее Ct±S.D.) |
|
|
C. sporogenes |
1,6·102 |
37,83±0,12 |
103 |
38,83±0,12 |
|
C. perfringens |
7,2·10 |
38,29±0,75 |
102 |
35,58±0,64 |
|
C. sordellii |
9,0·10 |
35,38±0,32 |
102 |
34,58±0,84 |
|
C. histolyticum |
1,5·102 |
35,55±0,46 |
103 |
36,25±0,44 |
|
C. septicum |
1,8·102 |
38,83±0,26 |
103 |
37,83±0,12 |
|
C. chauvoei |
9,2·10 |
35,39±0,55 |
– |
– |
|
C.novyi |
3,2·102 |
33,38±0,22 |
102 |
34,38±0,32 |
Результаты ПЦР с 10-кратными разведениями ПКО
и культуры бактерий. Показано только для C. perfringens (А) и C.novyi (Б)
Результаты показали, что среднее количество ПКО, выявляемое в реакции, составило
1,5 · 102 ГЭ и различалось для разных образцов. Минимально выявляемое количество ПКО составило 7,2 · 10 ГЭ на реакцию для C. perfringens, до 3,2 · 102 ГЭ на реакцию для C.novyi. Расчетная эффективность амплификации для различных ПКО была равна ≈ 92 % при достоверности аппроксимации (R2), равной от 0,9 865 до 0,9 931. Стандартные отклонения значений пороговых циклов находились в диапазоне от 0,12 до 0,75. Средние коэффициенты вариаций значений пороговых циклов при повторных исследованиях не превышали 1,91 %, что свидетельствует о высокой повторяемости результатов определения аналитической чувствительности ПЦР. Диагностическая чувствительность реакции составила от 102 до 103 КОЕ/мл с исследованными изолятами клостридий. Диагностическую чувствительность реакции для C. chauvoei не определяли из-за отсутствия выделенного изолята.
Для повышения чувствительности и специфичности разработанной реакции подобрали оптимальные концентрации MgCl2, dNTP, а также температурно-временной режим реакции, при которых наблюдалась наивысшая интенсивность сигнала флюоресценции при высокой специфичности.
Для определения специфичности реакции исследовали ранее выделенные изоляты клостридий, контрольные штаммы бактерий M. haemolytica, E. coli, P. multocida, S. typhimurium. Дополнительно для определения специфичности реакции провели исследование вакцины «ультрачойс 8» (Zoetis Inc., США), содержащую инактивированные формалином цельноклеточные C. chauvoi, C. septicum, C. novyi, C. sordellii, C. perfringens, C. haemolyticum. Специфическая реакция была только с клостридиями своего вида, но не с клостридиями других видов или другими видами бактерий.
Заключение. В результате проведенных исследований разработана мультиплексная ПЦР в режиме реального времени, позволяющая осуществлять видовую идентификацию клостридий в смешанных и чистых бактериальных культурах с высокой степенью чувствительности и специфичности.
